[發(fā)明專利]快速檢測(cè)氟羅沙星的免疫層析試紙及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310334327.8
• 申請(qǐng)日: 2013-08-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103439504A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡驍飛;張改平;鄧瑞廣;楊艷艷;柴書(shū)軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/531;G01N33/532
• 代理公司: 鄭州金成知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

1.?一種快速檢測(cè)氟羅沙星的免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護(hù)層固定在吸附層上，其特征是：吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上設(shè)有偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白印制的檢測(cè)印跡和用羊抗小鼠IgG抗體印制的對(duì)照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗氟羅沙星單克隆抗體。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白是通過(guò)以下方法得到的：

將5.3?mg?氟羅沙星、3.1?mg?DCC和1.7?mg?NHS先后溶于1.0?mL?DMF溶液中，室溫避光攪拌4?h，充分反應(yīng)后得到A液；稱取9.5?mg?BSA溶于2?mL?PBS緩沖液中，得到B液；在室溫磁力攪拌下，將A液逐滴加入B液中，4℃反應(yīng)9?h后用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min，取上清液，得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，貯藏于-20℃，備用。

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述吸附纖維層用聚偏二氟乙烯膜、尼龍膜、玻璃纖維棉或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標(biāo)抗體纖維層用吸附氟羅沙星的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成。

5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述???????????????????????????????????????????????偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。

6.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為平行排列的“︱︱”直線式印跡、“十十”字型排列印跡、“┬?┬”字型排列印跡、“┴?┴”字型排列印跡、“├├”字型排列印跡或“┤┤”字型排列印跡。

7.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：在吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層和吸水材料層上覆蓋有保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上偏向吸附纖維層一側(cè)0.3-0.6cm處印制有樣品標(biāo)記線。

8.?權(quán)利要求1所述快速檢測(cè)氟羅沙星免疫層析試紙的制備方法，其特征是：該方法包括以下步驟：

（1）氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物的制備

將5.3?mg?氟羅沙星、3.1?mg?DCC和1.7?mg?NHS先后溶于1.0?mL?DMF溶液中，室溫避光攪拌4?h，充分反應(yīng)后得到A液；稱取9.5?mg?BSA溶于2?mL?PBS緩沖液中，得到B液；室溫磁力攪拌下將A液逐滴加入B液中，4℃反應(yīng)9?h，用PBS透析3天，換液3次/天，透析完成后，4000rpm離心5min，取上清液，得到偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白，貯藏于-20℃，備用；

（2）抗氟羅沙星單克隆抗體的制備；

（3）氟羅沙星金標(biāo)抗體的制備；

（4）羊抗小鼠IgG抗體的制備；

用所得的氟羅沙星載體蛋白偶聯(lián)物在纖維素膜層上制成檢測(cè)印跡，用羊抗小鼠IgG抗體在纖維素膜層上制備對(duì)照印跡；氟羅沙星金標(biāo)抗體用于制備金標(biāo)抗體纖維層，然后依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成免疫層析試紙。

9.?根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是：所述氟羅沙星金標(biāo)抗體的制備方法如下：

沸騰的200mL?0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新蘚配制的1％檸檬酸鈉8mL，獲得直徑15-20nm的膠體金溶液，用0.1mol/L?的K₂CO₃調(diào)節(jié)pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存，備用；以1：2000的標(biāo)記比將待標(biāo)記的氟羅沙星單克隆抗體加入pH?8.5～9.5的金溶膠中，標(biāo)記10min后，加入20％的PEG10000至終濃度為0.05％，4℃、1500～3000rpm離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析進(jìn)行分離純化，獲得膠體金標(biāo)記的氟羅沙星抗體。

10.?根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是：所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；所述吸附纖維層用聚偏二氟乙烯膜、尼龍膜、玻璃纖維棉或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；金標(biāo)抗體纖維層用吸附氟羅沙星的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成；偶聯(lián)氟羅沙星的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。