[發(fā)明專利]一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S啟動(dòng)子的方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310334113.0
• 申請(qǐng)日: 2013-08-02
• 公開（公告）號(hào): CN103397093A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃新;翟聰聰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)CaMV35S啟動(dòng)子的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

CaMV35S是外源基因在植物中表達(dá)的常用調(diào)控元件，可作為轉(zhuǎn)基因生物的標(biāo)記，目前大部分轉(zhuǎn)基因生物都含有CaMV35S啟動(dòng)子。CaMV35S啟動(dòng)子的廣泛使用使其成為進(jìn)行轉(zhuǎn)基因初篩的首要目標(biāo)，因此可減少分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)的數(shù)量（Brunnert?et?al.,2001；Gu?et?al.,2009）。在風(fēng)險(xiǎn)分析和商業(yè)化過(guò)程中，考慮到轉(zhuǎn)基因生物的大規(guī)模篩選，篩選CaMV35S啟動(dòng)子也是一種有效的方法。

目前CaMV35S啟動(dòng)子的檢測(cè)主要有real-time?PCR方法，PCR-ELISA，LAMP等方法（Akiyama?et?al.,2009）。Quirasco等運(yùn)用real-time?PCR方法對(duì)墨西哥和美國(guó)零售市場(chǎng)上的大米樣品進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)CaMV35S啟動(dòng)子的篩查，不僅對(duì)樣品進(jìn)行定性判斷，而且能夠判定陽(yáng)性樣品是否超過(guò)0.09%的閾值（Quirasco?et?al.,2008）。由于花椰菜花葉病毒感染的植物或攜帶病毒的植物材料污染的樣品，容易造成假陽(yáng)性，在real-time?PCR中設(shè)計(jì)一個(gè)TaqMan-MGB探針（TaqMan?Minor?Groove?Binder?Probe），能夠識(shí)別樣品中的病毒外殼蛋白，因此可以區(qū)分轉(zhuǎn)基因樣品和病毒感染的樣品（Cankar?et?al.,2005）。Brunnert等運(yùn)用PCR-ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆品系Roundup?Ready（RR），可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因含量為0.1%的轉(zhuǎn)基因大豆，該方法適宜高通量和自動(dòng)化篩選轉(zhuǎn)基因大豆（Brunnert?et?al.,2001）。Fukuta等用實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆品系Roundup?Ready（RR），最低可以檢測(cè)到含量為0.5%的轉(zhuǎn)基因大豆（Fukuta?et?al.,2004）。陳金松等利用環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最低可檢測(cè)到6.5fg，該方法靈敏度較高，但是易發(fā)生交叉污染（陳金松等，2011）。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種特異性檢測(cè)含CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物的引物、方法及試劑盒。

本發(fā)明提供的一種檢測(cè)含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物的引物組合物，所述引物組合物中各引物分別具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ?ID№.1-SEQ?ID№.5所示的核苷酸序列；

2）在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ?ID№.1-SEQ?ID№.5所限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；

3）與1）或2）限定的DNA序列具有90％以上同源性，且可特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物的核苷酸序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。

所述引物組合物中，依次具有序列表中SEQ?ID№.1-SEQ?ID№.5所示核酸序列的引物的體積比為2:2:5:3:3

優(yōu)選的，所述引物組合物中，所述具有序列表中SEQ?ID№.4和SEQ?ID№.5所示的核苷酸序列的引物，在其5’端進(jìn)行了抗體標(biāo)記修飾。

所述抗體標(biāo)記修飾具體指具有序列表中SEQ?ID№.4核苷酸序列的引物在其5’端進(jìn)行了FITC標(biāo)記修飾，具有序列表中SEQ?ID№.4核苷酸序列的引物在其5’端進(jìn)行了BIOTIN標(biāo)記修飾。

本發(fā)明提供的一種檢測(cè)含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法為以所述的引物組合物為引物，以待測(cè)植物的基因組DNA或cDNA為模板，進(jìn)行交叉引物擴(kuò)增；若能擴(kuò)增出產(chǎn)物，則所述待測(cè)植物中候選含有CaMV35S啟動(dòng)子；若不能擴(kuò)增出產(chǎn)物，則所述待測(cè)植物中候選不含有CaMV35S啟動(dòng)子。

所述方法中，所述交叉引物擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：權(quán)力要求1或2所述的引物組合物、模板DNA或cDNA、交叉引物擴(kuò)增專用酶、交叉引物擴(kuò)增專用緩沖液、dNTPs混合物、甜菜堿溶液、MgSO₄和H₂O。

所述方法中，所述模板DNA或cDNA是從待測(cè)樣品中獲得的。

所述方法中，所述交叉引物擴(kuò)增專用酶具體為Bst?DNA聚合酶或Bst?DNA聚合酶大片段；所述Bst?DNA聚合酶大片段是指具有Bst?DNA聚合酶活性或功能的Bst?DNA聚合酶大片段；所述Bst?DNA聚合酶大片段可從NEB公司購(gòu)買獲得，貨號(hào)M0275M。