[發(fā)明專利]用于慶大霉素定量檢測的熒光二氧化硅標記的免疫層析試紙及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310333977.0
• 申請日: 2013-08-03
• 公開（公告）號: CN103439489A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 張改平;王方雨;宋春美;職愛民;胡驍飛;趙東
• 申請（專利權）人: 河南省農業(yè)科學院
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 鄭州金成知識產權事務所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

技術領域

本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙，特別是涉及一種基于熒光二氧化硅納米顆粒的用于定量檢測慶大霉素的免疫層析試紙及制備方法。

背景技術

慶大霉素（Gentamicin，GM）是氨基糖苷類抗生素的一種，主要作用于革蘭氏陰性細菌，由于其抗菌譜廣、療效佳且價格低廉而廣泛應用于獸醫(yī)臨床，對奶牛乳房炎、子宮內膜炎等有很好療效，也作為飼料藥物添加劑使用于配合飼料中。不規(guī)范用藥會引起畜產品尤其是泌乳動物的乳汁中有藥物殘留，對人類的健康構成潛在危害，造成耳毒性和腎臟毒性。國內外相繼規(guī)定了慶大霉素在動物性食品中的最高殘留限量，中華人民共和國農業(yè)部?2002年發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留量》中規(guī)定，動物性食品中?GM?的最大殘留量?MRL為100?ng·mL^-1，因此亟待加強?GM?的殘留檢測方法研究，從而為?GM的監(jiān)控提供可靠手段，為人民的食品安全提供保障。

目前國內外關于慶大霉素等殘留的檢測方法主要有微生物法、儀器分析和免疫分析標記技術三種。微生物法雖然原理簡單，操作方便，但測定所需的時間太長，靈敏度不高。檢測慶大霉素殘留的理化方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、質譜法（MS）和氣相色譜法等，雖然這些方法比較靈敏、精確，但由于花費大、時間長、技術要求高等原因而不適合大批量樣品的篩選。免疫分析標記技術作為一種快速、特異和靈敏度較高的檢測技術正逐步被應用于小分子藥物殘留的檢測。?

免疫分析標記技術是指以抗原抗體間的特異性反應為基礎，通過標記物對某種物質進行定性或定量檢測的研究。標記免疫分析一般是將酶、熒光素、放射性核素等標記物對抗體或抗原進行標記，這種標記物保持了抗體或抗原的活性，不影響標記物的活性，當它與相應抗體或抗原反應后，可以直接測定復合物中的標記物，直接對目標物質進行定量分析。通過標記物的信號放大作用，可以提高免疫分析的敏感性。因此，亟待加強該方面的研究和探討。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題：提供一種用熒光二氧化硅納米顆粒為標記的檢測慶大霉素免疫層析試紙及其制備方法，該層析試紙具有特異、靈敏、快速、簡便、能定量檢測微量慶大霉素的特點。

本發(fā)明的技術方案：

一種用于慶大霉素定量檢測的熒光二氧化硅標記的免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有用偶聯慶大霉素的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液或金黃色葡萄球菌蛋白A溶液印制的隱形對照印跡；所述熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體采用熒光二氧化硅納米顆粒標記的慶大霉素抗體制成。?

所述熒光二氧化硅納米顆粒的粒徑為50-100nm。

所述熒光二氧化硅納米顆粒標記的慶大霉素抗體是以下方法制備的：

將1g二氧化硅納米顆粒分散在甲苯溶液中，加入0.3-1mL?3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流12-24h；回流液冷卻后6500rpm離心5-10min，將得到的沉淀用無水乙醇洗滌，再將沉淀分散在無水乙醇中，得到氨基化的二氧化硅納米顆粒；

將慶大霉素抗體置于2-8℃、濃度0.025-0.05mol/L、pH9.5的CBS緩沖液中，透析8-12h；將氨基化的熒光二氧化硅納米顆粒10000-13000rpm離心4-8min，用所述CBS緩沖液洗滌，然后與透析后的慶大霉素抗體混合均勻，于2-8℃反應過夜，得到熒光二氧化硅的抗體復合物；向所得的抗體復合物中按1：50-120的體積比加入0.5mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，混勻，2-8℃反應8-12h；用質量濃度為2%的BSA溶液封閉過夜，10000-13000rpm離心4-8min，得沉淀；將沉淀用0.5mL濃度0.01-0.02mol/L、pH7.8的Tris-HCL緩沖液洗滌，得到所述的熒光二氧化硅納米顆粒標記的慶大霉素抗體，于4℃保存，備用。

所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料制成；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；???????????????????????????????????????????????偶聯慶大霉素的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍蛋白。