[發明專利]用于慶大霉素定量檢測的熒光二氧化硅標記的免疫層析試紙及制備方法

有效

• 申請號: 201310333977.0
• 申請日: 2013-08-03
• 公開（公告）號: CN103439489A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 張改平;王方雨;宋春美;職愛民;胡驍飛;趙東
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 鄭州金成知識產權事務所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

1.一種用于慶大霉素定量檢測的熒光二氧化硅標記的免疫層析試紙，底層為支撐層，中間層為吸附層，保護層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、熒光抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其特征在于：在纖維素膜層上設有用偶聯慶大霉素的載體蛋白溶液印制的隱形檢測印跡，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液或金黃色葡萄球菌蛋白A溶液印制的隱形對照印跡；所述熒光抗體纖維層采用吸附熒光抗體的玻璃纖維棉制成，熒光抗體采用熒光二氧化硅納米顆粒標記的慶大霉素抗體制成。

2.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征在于：所述熒光二氧化硅納米顆粒的粒徑為50-100nm。

3.根據權利要求2所述的免疫層析試紙，其特征在于：所述熒光二氧化硅納米顆粒標記的慶大霉素抗體是以下方法制備的：

將1g二氧化硅納米顆粒分散在甲苯溶液中，加入0.3-1mL?3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流12-24h；回流液冷卻后6500rpm離心5-10min，將得到的沉淀用無水乙醇洗滌，再將沉淀分散在無水乙醇中，得到氨基化的二氧化硅納米顆粒；

將慶大霉素抗體置于2-8℃、濃度0.025-0.05mol/L、pH9.5的CBS緩沖液中，透析8-12h；將氨基化的熒光二氧化硅納米顆粒10000-13000rpm離心4-8min，用所述CBS緩沖液洗滌，然后與透析后的慶大霉素抗體混合均勻，于2-8℃反應過夜，得到熒光二氧化硅的抗體復合物；向所得的抗體復合物中按1：50-120的體積比加入0.5mol/L的氰基硼氫化鈉溶液，混勻，2-8℃反應8-12h；用質量濃度為2%的BSA溶液封閉過夜，10000-13000rpm離心4-8min，得沉淀；將沉淀用0.5mL濃度0.01-0.02mol/L、pH7.8的Tris-HCL緩沖液洗滌，得到所述的熒光二氧化硅納米顆粒標記的慶大霉素抗體，于4℃保存，備用。

4.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙，支撐層用不吸水的韌性材料制成；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成；????????????????????????????????????????????????偶聯慶大霉素的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍蛋白。

5.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述隱形檢測印跡和隱形對照印跡為平行排列的“︱︱”直線式印跡、“十十”字型排列印跡、“┬?┬”字型排列印跡、“┴?┴”字型排列印跡、“├├”字型排列印跡或“┤┤”字型排列印跡。

6.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征是：所述保護層為覆蓋在吸附纖維層、熒光抗體纖維層及吸水材料層上的保護膜；在吸附纖維層與熒光抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該樣品標記線偏向吸附纖維層一側0.3-0.7cm。

7.根據權利要求1-6任一項所述的免疫層析試紙，其特征在于：所述熒光二氧化硅納米顆粒采用以下方法制備：

將47mmol氨丙基三乙氧基硅、7.1?mmol?BHHCT及3.55mmol?EuCl₃?6H₂O加入30μL環己烷中，超聲振蕩反應15分鐘后，反應液加入到含有1.1?mL水、4.74?g?Triton?X-100、3.64?g正辛醇及14.50?g環己烷的W/O型微乳液中，攪拌0.5小時后，加入200?μL的四乙氧基硅烷和200?μL的濃氨水，室溫攪拌反應24小時后，加入40?mL丙酮結束反應，將反應液離心后除去上清液，沉淀部分用乙醇和雙蒸水分別洗三次，得到所述的熒光二氧化硅納米顆粒，懸浮于水中備用。