[發(fā)明專利]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高油菜對鱗翅目害蟲抗性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310332971.1
• 申請日: 2013-08-01
• 公開（公告）號: CN103421840A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉克德;劉超;汪亞琴;張燕;林擁軍
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高油菜對鱗翅目害蟲抗性的方法，該方法可用于油菜轉(zhuǎn)基因抗蟲育種。

背景技術(shù)

鱗翅目（Lepidoptera?Linnaeus）害蟲是重要的農(nóng)作物害蟲，包括二化螟（Chilo?supperssalis）、三化螟（Tryporyza?incertulas)、棉鈴蟲（Heliothis?armigera）、小菜蛾（Plutella?xylostella?linnaeus）和菜青蟲（Pierisrapae?Linne）等害蟲，這些鱗翅目害蟲對水稻、棉花和油菜等農(nóng)作物造成嚴(yán)重危害。有資料顯示，來源于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis）的Bt基因?qū)[翅目害蟲具有顯著的抗性。該基因的編碼蛋白通常稱為δ-內(nèi)毒素（δ-endotoxins）或殺蟲結(jié)晶蛋白（insecticidal?crystal?protein,ICP），分子量一般為130-140kD。自1981年Schnepf等人克隆了第一個Bt基因，此后不斷有不同類型的Bt基因被發(fā)現(xiàn)和克隆，目前已發(fā)現(xiàn)的Bt基因共有300多種（楊大興等，2008）。利用Bt基因已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花、水稻和油菜等多種作物，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的種植，不僅減少了殺蟲劑的噴施，降低了對環(huán)境的污染，而且節(jié)約了農(nóng)作物的生產(chǎn)成本。近年來Bt作物的種植面積在全世界范圍內(nèi)持續(xù)增長，2011年全球Bt作物的種植面積已經(jīng)達到了6500萬公頃（James,2011）。

油菜是在世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要油料作物，主要栽培類型包括甘藍型油菜、芥菜型油菜和白菜型油菜。鱗翅目害蟲是油菜的主要田間害蟲，嚴(yán)重影響到油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。Stewart等（1996）最早利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將人工合成的Bt殺蟲基因cry?1Ac導(dǎo)入油菜，表明轉(zhuǎn)基因植株對小菜蛾、粉紋夜蛾和美洲棉鈴蟲的生長起到抑制作用。林良斌等（2002）利用Bt基因cry1轉(zhuǎn)化油菜，獲得了高抗菜青蟲的轉(zhuǎn)基因材料。

相比水稻、棉花等作物，目前Bt轉(zhuǎn)基因油菜類型過少，大面積用于生產(chǎn)時容易導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗性。

cry1C^*基因是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室的林擁軍、張啟發(fā)教授改造合成（中國發(fā)明專利號：ZL?02139081.9），他們以cry1Ca5序列為基礎(chǔ)，根據(jù)植物密碼子使用的偏愛性人工合成了cry1C^*基因的編碼序列，并在其5′端添加了提高基因表達效率的引導(dǎo)序列，同時在3′端添加了加尾識別序列。研究顯示，cry1C^*轉(zhuǎn)基因水稻株系對二化螟和三化螟表現(xiàn)高度抗性：在接種一齡二化螟或三化螟幼蟲后，其5天內(nèi)的幼蟲死亡率為100%或接近100%（唐微，2006）。

目前尚未見到有關(guān)利用cry1C^*基因培育抗蟲油菜的報道。利用cry1C^*基因培育具有抗蟲能力強的新型Bt轉(zhuǎn)基因油菜，對于豐富油菜抗蟲資源，促進油菜抗蟲育種的發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，針對目前油菜生產(chǎn)上鱗翅目害蟲小菜蛾、菜青蟲等為害嚴(yán)重的現(xiàn)狀，提供一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高油菜對鱗翅目害蟲抗性的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

（1）利用cry1C^*基因（中國發(fā)明專利：ZL?02139081.9）的雙元表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化油菜（包括甘藍型油菜、芥菜型油菜或白菜型油菜），以油菜無菌苗下胚軸為外植體，將侵染農(nóng)桿菌并進行共培養(yǎng)后的下胚軸切段轉(zhuǎn)移到含有篩選劑的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和芽再生培養(yǎng)基，通過篩選劑的篩選，將具有抗性的再生苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，將生根后的幼苗轉(zhuǎn)移到溫室進行培養(yǎng)；

（2）對轉(zhuǎn)化植株進行PCR和Southern雜交檢測，確定轉(zhuǎn)基因陽性株，PCR檢測和Southern雜交探針擴增，使用的特異引物如下：

正向引物：cry1C-F?5′-TCGACATCTTGAACAACCTT-3′；

反向引物：cry1C-R?5′-CTACTTTTGTGCTCTTTCAA-3′；

（3）通過實時定量RT-PCR對轉(zhuǎn)基因陽性株中cry1C^*基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，cry1C^*的擴增引物如下：

正向引物：cry1C-193F?5′-GGAATCGTTGGACCTTCTCA-3′；