[發明專利]利用轉基因技術提高油菜對鱗翅目害蟲抗性的方法

無效

• 申請號: 201310332971.1
• 申請日: 2013-08-01
• 公開（公告）號: CN103421840A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 劉克德;劉超;汪亞琴;張燕;林擁軍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.利用轉基因技術提高油菜對鱗翅目害蟲抗性的方法，其特征在于下列步驟：

（1）利用cry1C^*基因的雙元表達載體，通過農桿菌介導的方法轉化油菜，以油菜無菌苗下胚軸為外植體，將侵染農桿菌并進行共培養后的下胚軸切段轉移到含有篩選劑的愈傷組織誘導培養基和芽再生培養基上，將具有抗性的再生苗轉移到生根培養基中，將生根后的幼苗轉移到溫室進行培養；

（2）對轉化植株進行PCR和Southern雜交檢測，確定轉基因陽性株，PCR檢測和Southern雜交探針擴增，使用的特異引物如下：

正向引物：cry1C-F?5′-TCGACATCTTGAACAACCTT-3′；

反向引物：cry1C-R?5′-CTACTTTTGTGCTCTTTCAA-3′；

（3）通過實時定量RT-PCR對轉基因陽性株中cry1C^*基因的轉錄水平進行檢測，cry1C^*的擴增引物如下：

正向引物：cry1C-193F?5′-GGAATCGTTGGACCTTCTCA-3′；

反向引物：cry1C-391R?5′-CGATCACTCTGGTCCTGGTT-3′；

內參基因BnActin的擴增引物如下：

正向引物：actin-F?5′-ACAGTGTCTGGATCGGTGGTTC-3′；

反向引物：actin-R?5′-TGCCTCATCATACTCAGCCTTG-3′；

（4）利用ELISA方法對轉基因陽性株進行檢測，確定植株中Cry1C^*的蛋白含量；

（5）進一步對轉基因株系進行鱗翅目害蟲的抗蟲性鑒定，明確轉基因株系的抗性水平，獲得抗蟲轉基因油菜株系；

其中：

步驟（1）中所述的cry1C^*基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；

步驟（1）中所述的篩選劑，根據使用的雙元載體的選擇標記選擇對應的篩選劑，其中的篩選劑為草銨膦；

步驟（2）中所述的PCR擴增片段和Southern雜交探針序列如SEQ?ID?NO：3所示；

步驟（4）中所述的Cry1C^*蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

上述步驟中的培養基成分如下：

無菌苗培養基M₀：1/2MS，7g/L瓊脂粉（Agargel），pH=5.8；

液體培養基DM：MS，30g/L蔗糖，100μM乙酰丁香酮，pH=5.8；

共培養培養基M₁：MS,30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L?2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激動素，100μm乙酰丁香酮，2.5g/L植物凝膠（Phytagel），pH=5.8；

愈傷組織誘導培養基M₂：MS，30g/L蔗糖，18g/L甘露醇，1mg/L?2,4-二氯苯氧乙酸，0.3mg/L激動素，20mg/L硝酸銀，270mg/L替門汀，5mg/L草銨膦，2.5g/L植物凝膠,pH=5.8；

芽再生培養基M₃：MS，10g/L葡萄糖，0.25g/L木糖，0.6g/L?2-(N-嗎啉)乙烷磺酸，0.1mg/L吲哚乙酸，2mg/L反式玉米素，270mg/L替門汀，5mg/L草銨膦，2.5g/L植物凝膠，pH=5.8；

生根培養基M₄：1/2MS，10g/L蔗糖，0.5mg/L吲哚丁酸,150mg/L替門汀,8g/L瓊脂粉,pH=5.8。

2.根據權利要求1所述的利用轉基因技術提高油菜對鱗翅目害蟲抗性的方法，其特征在于：步驟（1）所述的轉化油菜包括甘藍型油菜、芥菜型油菜或白菜型油菜。

3.根據權利要求1所述的利用轉基因技術提高油菜對鱗翅目害蟲抗性的方法，其特征在于，步驟（2）中所述的PCR擴增的目標片段和Southern雜交探針大小為0.99kb。