[發明專利]一種集成檢測9種啤酒污染菌的方法

有效

• 申請號: 201310326506.7
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN103361439A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 董建華;陳嶸;陳璐;尹花;萬秀娟;趙玉祥;賀揚;孫力川;楊梅;劉佳
• 申請（專利權）人: 青島啤酒股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 青島聯信知識產權代理事務所 37227
• 代理人: 段秀瑛;王月玲

技術領域

本發明屬于啤酒技術領域用于啤酒污染菌檢測方法，特別涉及一種基于多重PCR技術以及毛細管電泳分離技術，用于啤酒中常見污染菌檢測的高通量、半定量分析方法。?

背景技術

啤酒的釀造過程是建立在純啤酒酵母的發酵和對污染微生物控制的基礎上的，啤酒中主要的污染微生物是帶有抗酒花基因的乳酸菌，對于此類微生物的檢測方式主要分為兩類，第一類是基于培養基的傳統培養法，國內外大多數啤酒廠采用此類方法，但檢測時間長，且只能定量不能定性到種屬，因此無法及時指導生產技術人員對啤酒生產過程進行監控；第二類是基于PCR技術的分子生物學檢測方法，PCR技術從核酸、基因水平極大地提高了檢測效率及靈敏度，能夠定性到種、屬或一類目標菌，檢測快速且定性能力強，因此無論對于成品啤酒質量的監控，或者生產過程問題的溯源排查，PCR技術的應用都具有廣闊的前景和深遠的意義，但一次反應只能檢測一類微生物。?

多重PCR技術是在同一PCR反應體系里加入兩對以上的引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，具有高效、高通量的特點，同時可以降低檢測成本。目前多重PCR技術已經在食品檢測及病原體診斷等多個方面得到廣泛應用，但由于易造成啤酒污染的乳酸菌種類多且同源性較高，需在各自種內保守區域逐一設計特異性引物，且由于多對單引物組成的多重PCR引物體系的設計規則復雜，設計過程需平衡引物體系內各單引物濃度，同時優化反應體系、調整擴增程序以保證多對引物的同步擴增，且受后期PCR產物在凝膠電泳中分辨率的限制的影響，目前的多重PCR反應至多只能做到5-6重PCR，仍無法滿足近十種啤酒污染菌的高通量的檢測需求。?

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的缺陷，克服常規啤酒中污染菌檢測技術操作繁瑣，費時耗力以及檢測種類少等不足，提供一種由9對引物組成的引物體系，通過采用高通量的多重PCR技術與高分辨率的毛細管電泳分離技術相結合的方式，從而實現對啤酒生產過程多種常見污染菌進行高通量、半定量的掃描式檢測。?

為解決上述問題，本發明采取的技術方案如下：?

由于啤酒中主要的污染微生物是帶有抗酒花基因的乳酸菌，本發明針對表1所述9種常見污染菌進行掃描式檢測。?

一種集成檢測9種啤酒污染菌的方法，采用9重PCR一次性同時擴增9種污染菌短乳桿菌Lactobacillus?brevis、干酪乳桿菌Lactobacillus?casei、乳酸桿菌Lactobacillus?coryniformi、植物乳桿菌Lactobacillus?plantarum、類丘狀乳桿菌Lactobacillus?paracollinoides、林氏乳桿菌Lactobacillus?lindneri、有害片球菌Pediococcus?damnosus、意外片球菌Pediococcus?inopinatus、克氏片球菌Pediococcus?clausenii，再通過毛細管電泳分離所述9重PCR的擴增產物，所述9重PCR反應中應用引物SEQIDNO.1-18。?

本發明一種集成檢測9種啤酒污染菌的方法，所述方法具體步驟如下：?

（1）啤酒污染菌的培養及DNA模板提取：?

將檢測樣品在厭氧環境中26℃靜置過夜富集培養；取培養液離心收集細胞沉淀；加入50mM?EDTA480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g離心2min，移去上清液，之后采用試劑盒提取啤酒污染菌的DNA模板；?

（2）多重PCR擴增?

PCR引物體系用于9種常見啤酒污染菌的定性檢測，由于乳酸菌在16SrDNA序列的高度保守性，因此本發明在各菌種此區域設計種內特異性引物，所用引物體系為表1所述的SEQ?ID?NO.1-18，20ul?PCR反應體系：200nM正向混?合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl₂4ul，5×PCR?Buffer?4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，補足雙蒸水使總體積為20ul；95℃預變性10min；以94℃?30s；58℃?30s；70℃?1min為1個循環，共進行35個循環；4℃保溫；?

表1本發明設計的用于啤酒污染菌鑒定到種的9重引物體系各引物序列?

（3）毛細管電泳分離條件?

分離體系：1ul所述步驟（2）中所得的擴增產物與95%去離子甲酰胺38.5ul，400bp?DNA?Marker?0.5ul混合均勻；在50℃、6.0KV電壓下，分離35min；?