[發明專利]一種集成檢測9種啤酒污染菌的方法

有效

• 申請號: 201310326506.7
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN103361439A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 董建華;陳嶸;陳璐;尹花;萬秀娟;趙玉祥;賀揚;孫力川;楊梅;劉佳
• 申請（專利權）人: 青島啤酒股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 青島聯信知識產權代理事務所 37227
• 代理人: 段秀瑛;王月玲

1.一種集成檢測9種啤酒污染菌的方法，其特征在于，采用9重PCR一次性同時擴增9種污染菌短乳桿菌Lactobacillus?brevis、干酪乳桿菌Lactobacillus?casei、乳酸桿菌Lactobacillus?coryniformi、植物乳桿菌Lactobacillus?plantarum、類丘狀乳桿菌Lactobacillus?paracollinoides、林氏乳桿菌Lactobacillus?lindneri、有害片球菌Pediococcus?damnosus、意外片球菌Pediococcus?inopinatus、克氏片球菌Pediococcus?clausenii，再通過毛細管電泳分離所述9重PCR擴增產物，所述9重PCR反應中應用引物SEQ?ID?NO.1-18。

2.根據權利要求1所述的集成檢測9種啤酒污染菌的方法，其特征在于，所述方法具體步驟如下：

（1）啤酒污染菌的培養及DNA模板提取：

將檢測樣品加入MRS肉湯培養基中在厭氧環境中26℃靜置過夜富集培養；取培養液離心收集細胞沉淀；加入50mM?EDTA?480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g離心2min，移去上清液，之后采用試劑盒提取啤酒污染菌的DNA模板；

（2）多重PCR擴增

所述應用引物為SEQ?ID?NO.1-18，20ulPCR反應體系：200nM正向混合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl₂4ul，5×PCR?Buffer?4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，補足雙蒸水使總體積為20ul；95℃預變性10min；以94℃?30s；58℃?30s；70℃?1min為1個循環，共進行35個循環；4℃保溫；

（3）毛細管電泳分離條件

分離體系：1ul所述步驟（2）中所得的擴增產物與95%去離子甲酰胺38.5ul，400bp?DNA?Marker?0.5ul混合均勻；在50℃、6.0KV電壓下，分離35min；

（4）檢測鑒定

所述步驟（2）中所得的擴增產物經過毛細管電泳分離時，通過多重基因表達遺傳分析系統自動檢索、收集樣品中熒光信號，所述9種啤酒污染菌的片段長度190bp、345bp、172bp、213bp、288bp、133bp、310bp、231bp、272bp相應位置分別得到污染菌短乳桿菌Lactobacillus?brevis、干酪乳桿菌Lactobacillus?casei、乳酸桿菌Lactobacillus?coryniformi、植物乳桿菌Lactobacillus?plantarum、類丘狀乳桿菌Lactobacillus?paracollinoides、林氏乳桿菌Lactobacillus?lindneri、有害片球菌Pediococcus?damnosus、意外片球菌Pediococcus?inopinatus、克氏片球菌Pediococcus?clausenii的特征峰；

（5）半定量分析

通過多重基因表達遺傳分析系統自動對所述步驟（4）中特征峰的峰面積積分得到PK值，所述的PK值與菌懸液濃度的對數值繪制標準曲線，對污染菌的數量進行半定量分析。

3.根據權利要求2所述的集成檢測9種啤酒污染菌的方法，其特征在于，所述步驟（5）中的菌懸液濃度為10¹～10⁵CFU/mL。