[發明專利]一種重組長效人透明質酸酶、其編碼基因、生產方法及應用

有效

• 申請號: 201310325056.X
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN104342420B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 惠覓宙;劉珊;吳書音;謝波;張欣
• 申請（專利權）人: 惠覓宙
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A61K38/47;A61K47/68;A61K47/64
• 代理公司: 北京方韜法業專利代理事務所11303
• 代理人: 馬麗蓮

技術領域

本發明主要涉及生物技術領域，特別是涉及一種重組長效人透明質酸酶、其編碼基因、生產方法及應用。

背景技術

透明質酸是真皮中主要的粘多糖形式，是由重復的二糖單元D－葡萄糖醛酸及N－乙酰葡糖胺組成的線性多糖。透明質酸能夠保持超過自身重量500倍的水分，形成非常粘稠的溶液，填充在胞外基質膠原蛋白纖維骨架之內，影響胞外基質的傳質特征。胞外基質是許多藥物進行皮下注射的主要障礙。膠原蛋白纖維構成的固態基架與嵌入富含透明質酸的黏性凝膠，造成一定的傳質阻力，限制了藥物代謝動力學以及能夠從同一位點進行皮下注射的液體體積，以及到達血管的速度和數量。

透明質酸酶是降解透明質酸的酶家族，通過催化透明質酸的水解，透明質酸酶降低透明質酸的黏度，可逆性地改變真皮的結構，由此提高組織的通透性。透明質酸酶半衰期15－20h，在體內更新時間短，皮膚能夠快速修復。基于透明質酸酶的打通胞外基質屏障給藥是一種新型高效給藥平臺。根據作用機理與降解產物的不同，可將透明質酸酶分為三類，第一類包括β－D－乙酰－D－己糖胺酶，將高分子量底物降解成四糖作為主要的終產物。睪丸透明質酸酶是這一種類的原型，它能夠催化轉糖基作用，因此，在水解透明質酸的過程中也會形成六碳糖、二糖以及八碳糖。第二類，以水蛭透明質酸酶為代表的透明質酸酶。第三類，細菌透明質酸酶，是一種裂解酶。

自1940s以來，動物組織中提取的含透明質酸酶活性的擴散因子已作為促擴散劑用于臨床給藥，但是其應用范圍一直限定于緊急情況，主要是因為對成分不完全明確的酶制劑中其他雜質成分的顧慮。動物組織提取透明質酸酶制劑中有效成分小于1％，絕大部分為異源雜質蛋白。繼中性人透明質酸酶基因發現之后，采用DNA來源的重組人源透明質酸酶(rHuPH20)取代動物源純化的透明質酸酶，降低了免疫原性，提升了安全性，應用范圍也隨之擴大，主要用于皮下輸液、眼周手術麻醉、化藥和生物藥促滲、尿路造影術中造影劑的吸收。

在許多實體瘤(包括前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌以及非小細胞肺癌)細胞表面都有透明質酸的富集，富含透明質酸的細胞微環境常與腫瘤發展之間存在關聯，提供了惡性腫瘤生長擴散的條件。采用透明質酸酶處理腫瘤生長的組織或器官或處理腫瘤細胞表面的透明質酸包裹層并聯合腫瘤治療藥物，提供了一種抗癌新策略。

但未改造的rHuPH20體內血液中半衰期短于1分鐘，無法經血液輸入并實現體內治療的效果，已有人使用聚乙二醇化學偶聯rHuPH20，生產了長效人透明質酸酶，并已用于人類臨床實驗治療腫瘤。

另一方面，透明質酸酶能夠降解人工生產的重組大分子量透明質酸，產生出小分子量透明質酸。小分子量透明質酸，包括含3－10個雙糖單位的小分子量透明質酸寡糖(oHA)能激活內皮細胞表面CD44并促進內皮細胞增殖，還能與血管內皮生長因子(VEGF)相協同，促進內皮細胞血管新生，是有生物效應的透明質酸形式。

因此，小分子量透明質酸在化妝品領域應用廣泛，因其分子量小，能滲入皮膚真皮層真皮，具有較強的生物效應。而目前工業生產小分子量透明質酸多采用酸堿降解或者超聲降解。

發明內容

本發明的目的是提供一種體內安全性高、半衰期長的重組長效人透明質酸酶。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：一種重組長效人透明質酸酶，為人透明質酸酶PH20細胞外部分與人源蛋白的融合蛋白，所述人源蛋白為人白蛋白HSA片段或人免疫球蛋白IgG2 Fc片段；人透明質酸酶PH20細胞外部分與人白蛋白HSA片段的融合蛋白為PH20－HSA，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；人透明質酸酶PH20細胞外部分與人免疫球蛋白IgG2 Fc片段的融合蛋白為PH20－IgFc，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

本發明的第二個目的是提供一種上述重組長效人透明質酸酶的編碼基因，采用如下技術方案：其基因序列如SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示。

本發明的第三個目的是提供一種包含SEQ ID No.6或SEQ ID No.7所示基因序列的表達載體及宿主細胞。