[發明專利]利用輔酶合成強化進行的羥基羧酸類的生產方法

無效

• 申請號: 201310323479.8
• 申請日: 2007-04-27
• 公開（公告）號: CN103397055A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 森重敬;和田光史;高橋均;望月大資;德田淳子
• 申請（專利權）人: 三井化學株式會社
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12N1/20;C12N1/21;C12R1/185;C12R1/01;C12R1/42;C12R1/18;C12R1/19
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 楊宏軍;王大方

本申請是中國發明專利申請號200780016224.X的分案申請。

技術領域

本發明涉及一種生產以乙醇酸為代表的羥基羧酸的微生物和使用微生物的生產以乙醇酸為代表的羥基羧酸的方法。

背景技術

羥基羧酸類作為聚合物原料或藥物中間體有用，故人們謀求其高效的生產方法。

作為其一例，可以舉出乙醇酸(α-羥基乙酸)。乙醇酸已逐漸用作洗滌劑或化妝品原料，但近年作為用作氣體隔離性聚合物或醫療用聚合物的聚乙醇酸原料受到關注。作為氣體隔離性材料受到關注的原因在于，聚乙醇酸層具有較高的氧氣隔離性，具有作為用于包裝在氧存在下易變質的食品或碳酸飲料的材料的性能。

目前市場上銷售的化學合成品的乙醇酸含有很多雜質，作為聚合物原料存在純度方面的問題。其原因在于，上述雜質不僅阻礙乙醇酸的脫水縮合反應，而且作為雜質之一的甲氧基乙酸是懷疑具有致癌性的化合物，故不希望包含在食品或飲料的包裝材料中。當然從技術上講可以通過精制除去雜質，但實際上，上述精制品的價格升高，作為廉價的包裝材料原料并不現實。

為了避免化學合成品的乙醇酸中出現的上述問題，人們正在嘗試通過以乙二醇作為原料的生物學方法來制造乙醇酸。

專利文獻1及專利文獻2中公開了通過微生物生產乙醇酸的方法，其特征在于，在含有乙二醇的培養基中培養屬于畢赤酵母(Pich?ia)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、擲孢酵母(Sporobolomyces)屬、克魯維酵母(Kluyveromyces)屬、球擬酵母(Torulopsis)屬的酵母、屬于諾卡氏菌(Nocardia)屬的菌株、屬于紅球菌(Rhodococcus)屬的菌株、或大腸桿菌B(Escherichia?coli?B)株，從培養液中分離·采集乙醇酸。

專利文獻1及專利文獻2的實施例記載的乙醇酸生產方法中，乙醇酸蓄積濃度最高的是使用內西畢赤酵母(Pichia?naganishii)的方法，經30小時的反應可以得到35.3g/L的乙醇酸。非專利文獻1中指出，對于使用內西畢赤酵母(Pichia?naganishii)的乙醇酸生產，進一步改善反應條件，經120小時的反應可以得到105g/L的乙醇酸。

專利文獻3中公開了將編碼乳醛還原酶(lactaldehyde?reductase)的基因和編碼乳醛脫氫酶(lactaldehyde?dehydrogenase)的基因以質粒的形態導入微生物，由此賦予或強化它們的酶活性，通過使用上述微生物，將以乙二醇為代表的末端具有羥基的脂肪族多元醇作為原料，可以生產以乙醇酸為代表的羥基羧酸，進而通過破壞微生物具有的編碼乙醇酸氧化酶的基因、使該酶活性鈍化，由此提高乙醇酸的生產率。

在利用上述現有方法生產以乙醇酸為代表的羥基羧酸的反應中，由于供給到反應中的菌體量多，所以存在以下問題，即，隨著菌體量多而導致制造成本升高或夾雜來自菌體的雜質，進而在羥基羧酸類制造后為了廢棄菌體而耗費大量勞力和成本。

在微生物中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的生物合成路徑，已知存在由天冬氨酸經喹啉酸進行生物合成的路徑(從頭(de?novo)路徑)、和將通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸等的代謝生成的煙酰胺再循環的路徑(再循環路徑)，以埃希氏菌(Escherichia)屬、志賀氏菌(Shige?lla)屬、沙門氏菌(Salmonella)屬、歐文氏菌(Erwinia)屬、耶爾森氏菌(Yersinia)屬、光桿狀菌(Photorhabdus)屬為代表的腸內細菌科中的上述生物合成路徑，已知被nadR(因文獻不同有時也稱為nadI)基因編碼的蛋白質(以下寫成NadR)所控制。即，已知NadR抑制由天冬氨酸開始的從頭(de?novo)路徑中的L-天冬氨酸氧化酶基因和喹啉酸合成酶基因、及再循環路徑中的煙酸磷酸核糖轉移酶(nicotinic?acid?phosphoribosyltransferase)基因(以下稱為pncB)的表達。

另一方面，NadR為多功能蛋白質，對于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸生物合成也具有以下重要的功能。即，已知也具有轉運成為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸前體的煙酰胺單核苷酸的功能，并且具有作為催化由ATP和煙酸核糖核苷酸生產作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸前體的脫酰胺(Deamido)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的反應的酶的功能、作為煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉移酶的功能。

非專利文獻2中已經報道了破壞基因nadR的微生物，但尚未報道利用上述微生物生產羥基羧酸。

非專利文獻3中報道了通過向大腸桿菌中導入pncB的表達載體，提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量。