[發明專利]一種重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201310323448.2
• 申請日: 2013-07-29
• 公開（公告）號: CN103387971A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 連小冬;張炯;陳智峰;孫環嶸
• 申請（專利權）人: 上海桂康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70;C07K16/40;C07K16/06;G01N33/573
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制備方法及其應用。

背景技術

胃蛋白酶原（PG）是胃粘膜細胞分泌的蛋白水解酶原，它屬于天門冬氨蛋白酶家族。在PH為1.0～5.0的酸性條件下，可以自動水解成胃蛋白酶。根據生化免疫學特性上可以分為PG?I（PGA），PG?II（PGC）兩大類，有7組胃蛋白酶同工酶原，1～5組分免疫原性近似，稱為PG?I，主要由胃腺主細胞的黏液頸細胞分泌；組分6～7被稱PG?II，來源于胃體胃底黏膜泌酸腺，胃賁門腺，胃竇幽門腺和遠端十二指腸Brunner氏腺，前列腺和胰腺也有少量產生。分泌后的PG大部分進入胃腸經過胃蛋白酶或胃酸水解，僅有1%的PG透過胃黏膜毛細血管進入血液循環，再通過腎排入尿中。

通常情況下，這1%的PG在血液中非常穩定。血清中PG?I和PG?II可以反映胃黏膜腺體和細胞的數量，也間接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。PG?I是檢測胃泌酸腺細胞功能的指針，胃酸分泌增多PG?I升高，分泌減少或胃粘膜腺體萎縮PG?I降低。PG?II與胃底粘膜病變的相關性較大（相對于胃竇粘膜），其升高與胃底腺管萎縮、胃上皮化生或假幽門腺化生、異型增值有關。PG?I/II比值進行性降低與胃粘膜萎縮進展相關。當胃黏膜發生病理變化時，血清PG含量也隨之改變。因此，監測血清中PG的濃度可以作為監測胃黏膜狀態的手段。

胃蛋白酶原（PG）在血清中的變化可反應胃黏膜變化，進一步提示胃部疾病的變化歷程，包括：淺表性胃炎，胃粘膜糜爛潰瘍，萎縮性胃炎，胃癌。由此在國外發達國家已經利用胃蛋白酶原作為體外診斷標志，進行于胃癌的大面積普查，使癌癥的提前診斷率提高到90%，所以運用胃蛋白酶原（PG）在我們國家進行大面積人群普查非常有意義。

當前，國內外胃蛋白酶原的診斷試劑有酶聯免疫法，化學發光法以及用于全自動生化分析儀的膠乳增強免疫比濁法，現市場上的《胃蛋白酶原檢測試劑盒》的原料主要有人胃蛋白酶原免疫后得到的PG抗體以及可制備成試劑盒校準品的胃蛋白酶原。雖然說胃蛋白酶原可以從人的胃部組織，尿液，精液等材料提取，但是從天然材料中提取困難重重，導致來源和數量受到了很大的限制。相對于PG?I，PG?II的天然提取更不易，采用基因工程的方法制備胃蛋白酶原不失為一個捷徑。現國內外就有用基因工程方法在大腸桿菌和酵母中表達了PG?I和PG?II：國內如徐曉晶等用酵母表達了人胃蛋白酶原C，國外如Ajamaluddin?Malik等在大腸桿菌胞周質表達了融合的天然胃蛋白酶原A，也有Takashi?Aoki等同時表達了人胃蛋白酶原A和C，可以在免疫分析試劑盒中作為試劑盒校準品使用。

然而胃蛋白酶原PG?II有兩個同工酶，它們在氨基酸序列上有所差異，并不完全一致，所以在胃蛋白酶原診斷試劑盒中，以多抗為原料的試劑中可能缺少一些針對另一同工酶的多抗，而以單抗為原料的試劑中可能缺少針對另一同工酶的更靈敏的單抗。在現有的文獻記錄中，也未曾報道過用于制備可同時產生針對于這兩種同工酶多抗或是可以同時篩選針對于兩同工酶單抗的胃蛋白酶原II嵌合蛋白。

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明的目的是提供一種重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。

本發明的另一個目的是提供一種上述重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制備方法，該方法用于制備可同時產生這兩種同工酶多抗或是同時篩選兩同工酶單抗的嵌合蛋白。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供了一種重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，

氨基酸序列為SEQ?ID?NO6；核苷酸序列為SEQ?ID?NO5。

本發明還提供了一種上述重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制備方法，包括以下步驟：以合成的人胃蛋白酶原II兩同工酶的基因序列為模板，經過PCR拼接取得嵌合蛋白編碼基因序列，構建重組表達質粒，篩選出的陽性克隆質粒轉化到表達宿主細胞，篩選高效表達重組嵌合蛋白菌株，擴大培養細胞及誘導表達嵌合蛋白，通過純化獲得重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，同工酶1核苷酸序列為SEQ?ID?NO7，同工酶2核苷酸序列為SEQ?ID?NO8。

作為一種優選的技術方案，所述PCR拼接取得嵌合蛋白編碼基因序列包括以下步驟：