[發明專利]一種重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201310323448.2
• 申請日: 2013-07-29
• 公開（公告）號: CN103387971A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 連小冬;張炯;陳智峰;孫環嶸
• 申請（專利權）人: 上海桂康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70;C07K16/40;C07K16/06;G01N33/573
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

1.一種重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，其特征在于，

氨基酸序列為SEQ?ID?NO6；核苷酸序列為SEQ?ID?NO5。

2.根據權利要求1所述的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：以合成的人胃蛋白酶原II兩同工酶的基因序列為模板，經過PCR拼接取得嵌合蛋白編碼基因序列，構建重組表達質粒，篩選出的陽性克隆質粒轉化到表達宿主細胞，篩選高效表達重組嵌合蛋白菌株，擴大培養細胞及誘導表達嵌合蛋白，通過純化獲得重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，同工酶1核苷酸序列為SEQ?ID?NO7，同工酶2核苷酸序列為SEQ?ID?NO8。

3.根據權利要求2所述的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制備方法，其特征在于，所述PCR拼接取得嵌合蛋白編碼基因序列包括以下步驟：

將人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和下游引物P2進行第一次PCR擴增；人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和下游引物P4進行第二次PCR擴增；將上述擴增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和擴增后的人胃蛋白酶原II同工酶2進行第三次PCR擴增，獲得PCR拼接取得嵌合蛋白編碼基因序列。

4.根據權利要求3所述的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制備方法，其特征在于，所述人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1的基因序列為5，TTCCATGGCAGTTGTCAAAGTTCCACTGAAGAAGTTT3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2的基因序列為5，GCTTCCACCGCCGCCTGCAGCAGTAGCGAAAC3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3的基因序列為5，GGCGGCGGTGGAAGCCTGGTTCTGGAATCTTCT3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4的基因序列為5，TTCTCGAGGGCACCAGAATGATGCTGACTACGTG3，；

所述第一次PCR擴增的條件為：在50ul擴增體系中取人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2各0.5ul，擴增條件為：94℃預熱5min，94℃40s，60℃40s，72℃1min20s，30個循環，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%瓊脂糖膠回收；

所述第二次PCR擴增的條件為：在50ul擴增體系中取人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4各0.5ul，擴增條件為：94℃預熱5min，94℃20s，63℃20s，72℃1min，30個循環，72℃延伸10min；PCR完成后，用1.2%瓊脂糖膠回收；

所述第三次PCR擴增的條件為：在50ul擴增體系中取擴增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和擴增后的人胃蛋白酶原II同工酶2各0.5ul，擴增條件為：94℃預熱5min，94℃45s，60℃45s，72℃1min30s，30個循環，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%瓊脂糖膠回收獲得PCR拼接的嵌合蛋白編碼基因序列。

5.根據權利要求2所述的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制備方法，其特征在于，所述構建重組表達質粒包括以下步驟：

把PCR拼接取得嵌合蛋白編碼基因序列用限制性內切酶NcoI和XhoI雙酶切，同時把表達載體用限制性內切酶NcoI和XhoI雙酶切，將酶切的目的基因與表達載體連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，PCR篩選陽性克隆質粒，用雙酶切進一步驗證其正確性。

6.根據權利要求5所述的重組人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制備方法，其特征在于，所述表達載體為pET-28a。