[發明專利]犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙及制備方法

有效

• 申請號: 201310323055.1
• 申請日: 2013-07-29
• 公開（公告）號: CN103399154A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 廖園園;漆世華;秦偉;劉潔;李建;謝紅玲;溫文生;朱薇;馮釗
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區、吸水區和支撐板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區和吸水區鋪設在支撐板上并依次相互部分重疊；所述的樣品吸收區包被有狂犬病毒抗原；所述的金標探針區包被有金標探針1和金標探針2；所述的金標探針1為膠體金標記的狂犬病毒單克隆抗體，金標探針2為膠體金標記的兔IgG；所述的固相化抗體區依次有對照線C1、測試線T、對照線C2和對照線C3；所述的對照線C1包被有羊抗兔IgG抗體，檢測線T包被有羊抗犬IgG抗體，對照線C2包被有羊抗兔IgG抗體，對照線C3包被有羊抗鼠IgG抗體。

2.根據權利要求1所述的犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述的狂犬病毒抗原的包被量為5～50μg；所述的狂犬病毒單克隆抗體的標記量為每mL膠體金標記5～20μg單抗，兔IgG的標記量為每mL膠體金標記1～10μg兔IgG；所述的對照線C1包被羊抗兔IgG抗體的量為0.05～0.5μg，檢測線T包被羊抗犬IgG抗體的量為0.5～5μg，對照線C2包被羊抗兔IgG抗體的量為0.5～5μg，對照線C3包被羊抗鼠IgG抗體的量為1～5μg。

3.根據權利要求1所述的犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙，其特征在于：所述的支撐板的材料為粘有一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板；所述的樣品吸收區的材料為玻璃纖維膜；所述的金標探針區的材料為聚酯膜；所述的固相化抗體區的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料為吸水濾紙。

4.權利要求1-3任一項所述的犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法，其特征在于包括如下步驟：將膠體金標記的狂犬病毒單克隆抗體和膠體金標記的兔IgG分別噴涂于聚酯膜上；在硝酸纖維素膜上依次包被對照線C1、測試線T、對照線C2和對照線C3；在玻璃纖維膜上包被狂犬病毒抗原；將玻璃纖維膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝到支撐板上得到犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙。

5.根據權利要求4所述的犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）狂犬病毒抗原的制備：將狂犬病毒懸液接種到已長成單層的Vero細胞上，35℃培養5～6天后，每隔3天連續收取培養上清液3次；將收集的病毒懸液濃縮40倍，并加入體積濃度為1/3000的甲醛溶液滅活病毒；將滅活的病毒懸液于5000r/min離心30分鐘去沉淀，上清液通過Sepharose?4FF層析柱進行純化得狂犬病毒抗原；

（2）狂犬病毒單克隆抗體的制備，包括下述步驟：

1）將前述純化的狂犬病毒抗原常規免疫Balb/c小鼠，當小鼠血清ELISA效價達到1:10000以上時，取脾細胞與骨髓瘤細胞以5×10⁷：1×10⁷的比例進行融合；用HAT選擇性培養基篩選雜交瘤細胞；用ELISA方法和間接免疫熒光方法進行陽性雜交瘤細胞的篩選；將篩選到的陽性雜交瘤細胞經三次有限稀釋得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株及狂犬病毒單克隆抗體；

2）將步驟1）制得的狂犬病毒單克隆抗體經硫酸銨沉淀，純化，制得純化的抗狂犬病毒單克隆抗體；

（3）膠體金標記狂犬病毒單克隆抗體的方法：分別取半徑為10～40nm濃度為0.01%的膠體金20mL及狂犬病毒單克隆抗體100～400μg，在pH8.5～9.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加BSA和PEG20000作為穩定劑，且使得BSA最終質量濃度為0.1～5%，PEG20000最終質量濃度為0.01～0.1%，采用離心法除去未結合的狂犬病毒單克隆抗體和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金－狂犬病毒單克隆抗體復合物；

（4）膠體金標記兔IgG的方法：分別取半徑為10～40nm濃度為0.01%的膠體金20mL及兔IgG?20～200μg，在pH8.5～9.2的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加BSA和PEG20000作為穩定劑，且使得BSA最終質量濃度為0.1～5%，PEG20000最終質量濃度為0.01～0.1%，采用離心法除去未結合的兔IgG和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金－兔IgG復合物；

（5）將膠體金標記的狂犬病毒單克隆抗體和膠體金標記的兔IgG分別噴涂于聚酯膜上：用20mL含1%BSA的PBS分別洗滌膠體金－狂犬病毒單克隆抗體復合物和膠體金－兔IgG復合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2mL含1%BSA的PBS溶解，用噴涂設備分別涂于聚酯膜上，凍干；

（6）硝酸纖維素膜的包被：在硝酸纖維素膜依次包被對照線C1、測試線T、對照線C2和對照線C3；檢測線T包被的是羊抗犬IgG抗體，包被量0.5～5μg，對照線C1包被的是羊抗兔IgG抗體，包被量0.05～0.5μg，對照線C2包被的也是羊抗兔IgG抗體，包被量0.5～5μg，對照線C3包被的是羊抗鼠IgG抗體，包被量1～5μg，每條線寬1～3mm；

（7）玻璃纖維膜的包被：將前述純化的狂犬病毒抗原用適量的PBS溶解后包被在玻璃纖維膜上，包被量為5～50μg；

（8）試紙組裝：用粘上一層聚氯乙烯襯膜的聚乙烯板作為支撐載體，上面依次鋪設包被有純化的狂犬病毒抗原的玻璃纖維膜、金標探針的聚酯膜、硝酸纖維素膜和吸水濾紙，外面用膠帶包封制成。

6.權利要求1-3任一項所述的犬抗狂犬病毒IgG抗體膠體金免疫層析檢測試紙的使用方法，其特征在于包括如下步驟：將所述試紙的樣品吸收區一端浸入待檢血清樣品中，5～10分鐘后判讀結果：對照線C1、C2、C3均出現紅色，表示試紙有效；對比檢測線T和對照線C1、C2的顏色，檢測線T顏色較對照線C2顏色深，表明抗體強陽性；檢測線T顏色介于對照線C1和C2之間，表明抗體陽性；檢測線T顏色較對照線C1顏色淺或無顏色出現，表明血清中沒有狂犬病抗體或抗體量不足。