[發(fā)明專(zhuān)利]一種11個(gè)耳聾易感基因的PCR-LDR檢測(cè)試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310321447.4
• 申請(qǐng)日: 2013-07-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103352086A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 步迅;張全芳;劉艷艷;夏子芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種11個(gè)耳聾易感基因的PCR-LDR檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

耳聾是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)生活質(zhì)量的常見(jiàn)先天性疾病，它可以由單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變引起，也可由環(huán)境因素(如醫(yī)療因素，環(huán)境暴露，創(chuàng)傷，藥物等)或基因和環(huán)境兩者共同作用而致。我國(guó)現(xiàn)有聽(tīng)力殘疾人群2780萬(wàn)，居各類(lèi)殘疾之首(33％)。有研究發(fā)現(xiàn)GJB2、SLC26A4、線(xiàn)粒體基因是導(dǎo)致中國(guó)大部分非綜合征性耳聾的3個(gè)最常見(jiàn)的致病基因。

GJB2基因是第一個(gè)被克隆和鑒定的遺傳性耳聾致病基因，也是導(dǎo)致非綜合性耳聾最常見(jiàn)的致病基因。在非綜合征性耳聾中，約有20％是GJB2基因突變導(dǎo)致的。GJB2基因編碼的Cx26蛋白在耳蝸內(nèi)呈高水平表達(dá)，與相鄰細(xì)胞的縫隙連接蛋白組成一個(gè)完整的縫隙連接通道。這些通道在信息傳遞和物質(zhì)交換中起重要作用，是電解質(zhì)、第二信使和代謝產(chǎn)物在細(xì)胞間轉(zhuǎn)換的重要通道。GJB2基因突變后，使鉀離子回流進(jìn)入內(nèi)淋巴的循環(huán)受到影響，導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。GJB2基因最常見(jiàn)的突變類(lèi)型是235delC，其次是299-230delA＞T和176-191del16，其等位基因頻率分別為11.90％、2.22％和0.65％。病理性235delC突變導(dǎo)致移碼突變，產(chǎn)生無(wú)功能的蛋白質(zhì)，使縫隙連接缺損，從而影響離子通道的正常開(kāi)閉。299-300delAT突變導(dǎo)致Cx26多肽的CL區(qū)大部分缺失，TM3、EC2和TM4區(qū)完全缺失，可能喪失對(duì)縫隙連接通道pH值的調(diào)控，降低縫隙連接對(duì)異型蛋白的辨別能力。176-191del16指176位后16個(gè)堿基丟失，從59號(hào)密碼子開(kāi)始移碼，使得終止密碼提前至75號(hào)，產(chǎn)生無(wú)功能的蛋白質(zhì)。

SLC26A4基因?qū)儆陔x子轉(zhuǎn)運(yùn)體26A家族(solute?carder?family26A。SLC26A)，編碼離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白。在機(jī)體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。SLC26A4基因突變可導(dǎo)致常染色體隱性耳聾DFNB4和Pendred綜合征(前庭水管擴(kuò)大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫)。SLC26A4基因最常見(jiàn)突變類(lèi)型是IVS7-2A＞G，此外還包括2168A＞G，1226G＞A，1174A＞T，1975G＞C，2027T＞A等熱點(diǎn)突變。

線(xiàn)粒體DNA突變是引起聽(tīng)力損傷的重要原因之一。其中，線(xiàn)粒體12S?rRNA基因突變與綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾相關(guān)，位于12S?rRNA解碼區(qū)的1555A＞G和1494C＞T突變是造成氨基糖甙類(lèi)抗生素耳毒性和非綜合征型耳聾常見(jiàn)的分子機(jī)制。這些突變可能造成12S?rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，破壞了線(xiàn)粒體蛋白的合成，降低細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，是細(xì)胞內(nèi)外離子濃度失衡，耳蝸毛細(xì)胞凋亡，由此引起的線(xiàn)粒體功能障礙導(dǎo)致耳聾。

目前常用的基因多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)主要包括：直接測(cè)序技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、DNA芯片技術(shù)(Micro?array)、變性高效液相色譜(DHPLC)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)等。這些方法分別存在這成本高、準(zhǔn)確率低、操作繁瑣和重復(fù)性差等問(wèn)題。本試劑盒采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測(cè)反應(yīng)(polymerase?chain?reaction-ligase?detection?reaction，PCR-LDR)結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)來(lái)檢測(cè)11個(gè)耳聾易感基因，LDR的原理是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的識(shí)別，若高溫連接酶一旦檢測(cè)到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對(duì)應(yīng)處存在著單個(gè)核苷酸的錯(cuò)配，即會(huì)阻止雜交探針的連接。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)11個(gè)耳聾易感基因GJB2：235delC、299-230delA＞T、176-191del16，SLC26A4：IVS7-2A＞G、2168A＞G、1226G＞A、1174A＞T、1975G＞C、2027T＞A，線(xiàn)粒體12SrDNA：1555A＞G和1494C＞T的PCR-LDR檢測(cè)試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，該試劑盒包括PCR擴(kuò)增和LDR反應(yīng)試劑；包括6對(duì)PCR引物、12組探針、1組通用探針和11組檢測(cè)探針。