[發明專利]一種檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體的阻斷ELISA方法

在審

• 申請號: 201310320409.7
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103342740A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 趙欽;周恩民;劉寶元;孫亞妮;李爽
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C07K16/10;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京漢昊知識產權代理事務所(普通合伙) 11370
• 代理人: 孟海娟

1.一種編碼禽戊型肝炎病毒中國分離株（Hepatitis?E?virus,HEV,CaHEV,Genbank?number?GU954430）衣殼蛋白的氨基酸序列，其特征在于，禽戊型肝炎病毒中國分離株的ORF2蛋白C端268個氨基酸，該氨基酸序列與SEQ?ID?NO.1相同。

2.一種蛋白，其特征在于，所述蛋白是原核表達的重組蛋白，名稱為aHEV-ORF2-268，作為蛋白包被抗原，其氨基酸序列與SEQ?ID?NO.1相同。

3.一種蛋白，其特征在于，所述蛋白是aHEV-ORF2-268的特異性抗體，名稱為單抗1H5。

4.一種檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體的阻斷ELISA方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在96孔酶標板上加入200ng/孔的原核表達的重組蛋白aHEV-ORF2-268，包被緩沖液為0.1M?PBS，4℃包被過夜，使用包含0.5%Tween-20的PBST洗板5次;

2）每孔加入200μl含2.5%脫脂奶粉的PBST封閉液，室溫封閉1小時，PBST洗板；

3）加入稀釋的待檢血清，100μl/孔，設置標準陰性血清對照和標準陽性血清對照，室溫孵育1小時，PBST洗板；

4）加入稀釋的單抗1H5，100μl/孔，室溫孵育1小時，PBST洗板；

5）加入稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，100μl/孔，室溫孵育1小時，PBST洗板；

6）加入TMB底物溶液，100μl/孔，室溫作用15min，每孔加入終止液50μl3M?H2SO4終止反應；

7）以450nm單波長測定OD值，計算阻斷率，進行結果判斷。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，PBS的pH值為7.2。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（3）中，待檢血清的稀釋比例為1:10。

7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（4）中，單抗1H5的濃度為0.8μg/ml，單抗1H5的稀釋比例為1:1000。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟（7）中，所述阻斷率（%）=[（陰性血清OD_450nm的值﹣檢測樣品的OD_450nm的值）/陰性血清OD_450nm的值]×100%；

所述判斷的標準如下：

當阻斷率≥20.73％時判斷血清抗體陽性，

當阻斷率＜15.71％時判斷血清抗體為陰性，

當15.71%＜阻斷率＜20.73%判斷為可疑，需重復檢測，如果仍低于20.73%，則判為陰性。

9.一種檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體的阻斷ELISA的模型，其特征在于，所述模型為：

阻斷率（%）=[（陰性血清OD_450nm的值﹣檢測樣品的OD_450nm的值）/陰性血清OD_450nm的值]×100%；

判斷標準如下：

當阻斷率≥20.73％時判斷血清抗體陽性，

當阻斷率＜15.71％時判斷血清抗體為陰性，

當15.71%＜阻斷率＜20.73%判斷為可疑，需重復檢測，如果仍低于20.73%，則判為陰性。