[發明專利]一種檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體的阻斷ELISA方法

在審

• 申請號: 201310320409.7
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103342740A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 趙欽;周恩民;劉寶元;孫亞妮;李爽
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C07K16/10;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京漢昊知識產權代理事務所(普通合伙) 11370
• 代理人: 孟海娟

技術領域

本發明屬于血清學診斷領域，涉及禽戊肝病毒ORF2重組蛋白（aHEV-ORF2-268）,識別該蛋白的單抗1H5及檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體的阻斷ELISA方法。

背景技術

禽戊型肝炎病毒（Hepatitis?E?virus，HEV）是雞的大肝大脾病（Big?liver?and?spleen?disease，BLS）或肝炎脾大（Hepatitis-Splenomegaly，HS）綜合癥的主要病原，主要感染30-72周齡的蛋雞和肉種雞，引起雞的死淘率升高和產蛋率下降，部分雞腹部充血，卵巢退化，偶有肝脾腫大。

2001年Haqshenas等學者首次對禽HEV的基因組進行了描述，隨后歐洲、澳大利亞也都描述了禽HEV本國分離株的基因序列。通過序列分析發現，禽HEV與人、豬HEV的同源性僅為50%左右，但是與哺乳動物的HEV在遺傳性和抗原性上是有一定相關性的；另外，禽HEV分為3個基因型，這種分型似乎與地域相關，但是其血清型可能只有1個。

2010年國內首個禽HEV分離株的全基因組序列被描述，發現與其歐洲的分離株同源性較高98%，與美國和澳大利亞的為82%左右，并且屬于禽HEV基因3型。

目前為止，禽HEV一直沒有合適有效的體外培養系統，因此對該病毒的診斷通常是通過RT-PCR檢測病毒的核酸和間接ELISA檢測血清中的抗體。

關于血清學的ELISA診斷技術，美國的研究學者利用禽HEV當地分離株，原核表達該分離株的衣殼蛋白的后半段建立了禽HEV抗體檢測的間接ELISA方法，但是該方法僅限于實驗室用，并沒有商業化合推廣使用，另一方面該ELISA方法所用的抗原是用基因2型禽HEV分離株的衣殼蛋白建立的，而國內禽HEV的分離株是基因3型，目前尚未有抗原是用基因3型禽HEV分離株的衣殼蛋白建立抗體檢測的ELISA方法。

目前，國內外還沒有檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體阻斷ELISA方法的報道。

發明內容

本發明的目的提供原核表達的禽戊型肝炎病毒ORF2蛋白C端268個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1。以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。

本發明的另一目的是利用禽戊型肝炎病毒中國分離株(Hepatitis?E?virus?from?China,CaHEV,Genbank?number?GU954430)ORF2蛋白的單抗1H5和上述蛋白，提供一種檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體的阻斷ELISA方法。

利用國內禽HEV分離株的衣殼蛋白建立抗體檢測的ELISA方法。而ELISA方法中，單抗阻斷ELISA或競爭ELISA因能排除包被抗原中的雜蛋白成分的干擾而具有良好的特異性。

本專利所描述的方法即是采用間接包被抗原的單克隆抗體阻斷ELISA方法。其特點在于，利用單克隆抗體具有高度均質性和高度特異性的特點，以特異性單克隆抗體作為檢測抗體，使得該方法更加特異與敏感，而且可以用于檢測多種易感動物的血清，不同于間接ELISA方法，每種動物血清都要配備相應的酶標抗體。因此，本專利相對間接ELISA方法而言具有在方法學上的優越性。

本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：

本發明的第一方面，一種編碼禽戊型肝炎病毒中國分離株（Hepatitis?E?virus,HEV,CaHEV,Genbank?number?GU954430）衣殼蛋白的氨基酸序列，其特征在于，禽戊型肝炎病毒中國分離株的ORF2蛋白C端268個氨基酸，該氨基酸序列與SEQ?ID?NO.1相同。

本發明的第二方面，一種蛋白，其特征在于，所述蛋白是原核表達的重組蛋白，名稱為aHEV-ORF2-268，作為蛋白包被抗原，其氨基酸序列與SEQ?ID?NO.1相同。該蛋白包被抗原是通過基因工程技術制備，其原核表達、鑒定、純化方法詳見實施例1。

本發明的第三方面，一種蛋白，其特征在于，所述蛋白是aHEV-ORF2-268的特異性抗體，名稱為單抗1B5。單抗1B5是將重組蛋白免疫BABL/c小鼠，通過傳統的雜交瘤細胞技術制備的，具體方法詳見實施例2。

本發明的第四方面，一種檢測禽戊型肝炎病毒特異性抗體的阻斷ELISA方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）在96孔酶標板上加入200ng/孔的原核表達的重組蛋白aHEV-ORF2-268，包被緩沖液為0.1M?PBS，4℃包被過夜，使用包含0.5%Tween-20的PBST洗板5次；

步驟（1）中，PBS的pH值為7.2。