[發明專利]一種快速鑒定病原真菌的方法

有效

• 申請號: 201310320242.4
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103343168A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 晏立英;廖伯壽;雷永;黃家權;萬麗云;溫少華
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 唐萬榮

技術領域

本發明屬于病原真菌鑒定領域，具體涉及一種快速鑒定病原真菌的方法。

背景技術

花生病原真菌危害花生造成產量損失，影響產品的質量。為了有效防治病害，需要快速鑒定花生的病原，及時針對性防治該病害。目前對真菌除了傳統的形態學鑒定外，為了得到更準確的信息，一般依賴對真菌基因組DNA信息的了解，通過真菌通用的PCR引物對真菌基因組核糖體DNA內轉錄間隔區擴增后得到的PCR產物進行序列分析。常規真菌DNA的提取方法為：將液體培養5-7d得到真菌菌絲團進行過濾，干燥或液氮冷凍處理后通過CTAB或SDS法破碎真菌菌絲細胞壁，再通過苯/氯仿抽提去除蛋白，最后經過異丙醇或者乙醇沉淀得到真菌DNA。將得到的真菌DNA經過PCR擴增獲得目的基因片段，再通過凝膠電泳后回收目的基因片段連接到T載體上，并轉化細菌感受態細胞，轉化的感受態細胞涂布平板培養后獲得的單克隆通過PCR鑒定為陽性克隆，陽性克隆經過培養后的菌液提交進行序列分析。該傳統方法中，真菌培養的時間比較長，需要真菌菌絲的量較多，真菌DNA提取的方法花費時間較長，耗費的試劑和人力成本也較高，步驟繁瑣，真菌DNA通過PCR擴增后連接載體，轉化細菌感受態，獲得的克隆進行鑒定也需要至少2天時間，再加上后續的測序時間，傳統的鑒定方法至少需要2周左右的時間。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種操作簡單、成本低、通量高、并適用于快速鑒定病原真菌的鑒定方法。

為實現發明目的，本發明的技術方案為：

一種快速鑒定病原真菌的方法，包括如下步驟：

（1）培養待鑒定真菌，得到真菌菌絲體、菌核、或分生孢子；

（2）取上述真菌菌絲體、菌核、或分生孢子置于緩沖液中，進行微波熱振破壁處理后，置于冰上，離心后取上清液，即為真菌DNA提取液；

（3）利用真菌通用引物ITS1和ITS4對上述真菌DNA提取液進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，再利用PCR回收試劑盒回收純化得到目的片段；

（4）將上述目的片段直接進行序列分析，得到的核苷酸序列在NCBI網站利用blast搜索與之相匹配的真菌序列，匹配長度最長，序列一致性為100%的真菌判定為被鑒定真菌所屬的真菌。

上述方案中，步驟（1）所述待鑒定真菌選自：花生黃曲霉菌、花生白絹病菌、花生焦斑病菌、花生鐮刀病菌、花生鏈格孢菌、蘋果紋枯病菌、番茄葉霉病菌、小麥全蝕病菌、草坪幣斑病菌、棉花黃萎病菌、瓜類蔓枯病菌、水稻稻曲病菌、黃瓜黑星病菌、玉米彎孢病菌、甘薯黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、黃瓜枯萎病菌、哈密瓜枯萎病菌、白菜黑斑病菌、高粱立枯病菌、柑橘瘡痂病菌、麻黃串珠鐮刀真菌、辣椒炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、或禾谷鐮刀真菌。

上述方案中，步驟（1）所述真菌在PDA培養基或察氏培養基上進行平板或斜面培養。

上述方案中，步驟（1）所述真菌在PDA培養基上28℃暗培養1～5天至菌落長至2～3cm，得到所述真菌菌絲體；或所述真菌在PDA培養基上28℃黑暗培養7～15天，得到所述菌核；或所述真菌在察氏培養基上28℃黑暗培養5～7天，得到所述分生孢子。

上述方案中，步驟（2）所述真菌菌絲體、菌核、或分生孢子的質量為0.2～2mg。

上述方案中，步驟（2）所述緩沖液為TE緩沖液，其組成成分為：10mMTris-HCl，1mM?EDTA，pH=8.0。

上述方案中，步驟（2）所述微波熱振破壁處理的微波功率為750W，微波處理的時間為30s～5min。

上述方案中，步驟（2）所述微波熱振破壁處理后，立即置于冰上5～10min，然后進行離心。

上述方案中，所述離心在室溫下進行，離心的轉速為10000rpm，離心的時間為1～2min。

上述PCR擴增的體系為：10×Taq?buffer2μl、10pmol的ITS1引物和ITS4引物各1μl、真菌DNA提取液2μl、1U?Taq?DNA?polymerase1μl、2.5mM?MgCl₂1μl、及2mmol/L?dNTPs1μl，再用滅菌水補足至20μl；擴增條件為：94℃3min變性，94℃30s，51℃30s，72℃1min，35個循環，72℃7min延伸。