[發明專利]一種快速鑒定病原真菌的方法

有效

• 申請號: 201310320242.4
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103343168A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 晏立英;廖伯壽;雷永;黃家權;萬麗云;溫少華
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 唐萬榮

1.一種快速鑒定病原真菌的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）培養待鑒定真菌，得到真菌菌絲體、菌核、或分生孢子；

（2）取上述真菌菌絲體、菌核、或分生孢子置于緩沖液中，進行微波熱振破壁處理后，置于冰上，離心后取上清液，即為真菌DNA提取液；

（3）利用真菌通用引物ITS1和ITS4對上述真菌DNA提取液進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，再利用PCR回收試劑盒回收純化得到目的片段；

（4）將上述目的片段直接進行序列分析，得到的核苷酸序列在NCBI網站利用blast搜索與之相匹配的真菌序列，匹配長度最長，序列一致性為100%的真菌判定為被鑒定真菌所屬的真菌。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于步驟（1）所述待鑒定真菌選自：花生黃曲霉菌、花生白絹病菌、花生焦斑病菌、花生鐮刀病菌、花生鏈格孢菌、蘋果紋枯病菌、番茄葉霉病菌、小麥全蝕病菌、草坪幣斑病菌、棉花黃萎病菌、瓜類蔓枯病菌、水稻稻曲病菌、黃瓜黑星病菌、玉米彎孢病菌、甘薯黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、黃瓜枯萎病菌、哈密瓜枯萎病菌、白菜黑斑病菌、高粱立枯病菌、柑橘瘡痂病菌、麻黃串珠鐮刀真菌、辣椒炭疽病菌、黃瓜炭疽病菌、或禾谷鐮刀真菌。

3.根據權利要求1所述方法，其特征在于步驟（1）所述真菌在PDA培養基或察氏培養基上進行平板或斜面培養。

4.根據權利要求1所述方法，其特征在于步驟（1）所述真菌在PDA培養基上28℃暗培養1～5天至菌落長至2～3cm，得到所述真菌菌絲體；或所述真菌在PDA培養基上28℃黑暗培養7～15天，得到所述菌核；或所述真菌在察氏培養基上28℃黑暗培養5～7天，得到所述分生孢子。

5.根據權利要求1所述方法，其特征在于步驟（2）所述真菌菌絲體、菌核、或分生孢子的質量為0.2～2mg。

6.根據權利要求1所述方法，其特征在于步驟（2）所述緩沖液為TE緩沖液，其組成成分為：10mM?Tris-HCl，1mM?EDTA，pH=8.0。

7.根據權利要求1所述方法，其特征在于步驟（2）所述微波熱振破壁處理的微波功率為750W，微波處理的時間為30s～5min。

8.根據權利要求1所述方法，其特征在于步驟（2）所述微波熱振破壁處理后，立即置于冰上5～10min，然后進行離心。

9.根據權利要求1所述方法，其特征在于所述離心在室溫下進行，離心的轉速為10000rpm，離心的時間為1～2min。

10.根據權利要求1所述方法，其特征在于所述PCR擴增的體系為：10×Taq緩沖液2μl、10pmol的ITS1引物和ITS4引物各1μl、真菌DNA提取液2μl、1UTaq?DNA聚合酶1μl、2.5mM?MgCl₂1μl、2mmol/L?dNTPs1μl、及滅菌水補足至20μl；擴增條件為：94℃3min變性，94℃30s，51℃30s，72℃1min，35個循環，72℃7min延伸。