[發明專利]PcDNA3.1(+)-Fbw7重組質粒及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201310319435.8
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103352051A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 李文崗;谷樂;郭躍
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬成功醫院;廈門大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.PcDNA3.1(+)-Fbw7重組質粒，其特征在于是通過提取人Fbw7基因全長，以含新霉素篩選標簽的PcDNA3.1(+)質粒為載體，在PcDNA3.1(+)的和限制性酶切位點EcoRⅠ和Not?Ⅰ之間插入Fbw7基因全長，構建的一種含Fbw7基因全長和新霉素篩選標簽的PcDNA3.1(+)-Fbw7重組質粒。

2.如權利要求1所述PcDNA3.1(+)‐Fbw7重組質粒的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)將PSG5‐Myc‐Fbw7質粒譜圖信息與PcDNA3.1(+)質粒譜圖信息比較，確定雙酶切位點EcoRⅠ和NotⅠ；

2)雙酶切PSG5‐Myc‐Fbw7質粒，具體反應體系如下：

PSG5‐Myc‐Fbw71μg，EcoRⅠ1.0μL，NotⅠ1.0μL，1×H2.0μL，BSA2.0μL，滅菌超純水補至20μL，各組份混勻后，將其置于37℃水浴中2h；

3)雙酶切PcDNA3.1(+)質粒載體，具體反應體系如下：

PcDNA3.1(+)1μg，EcoRⅠ1.0μL，NotⅠ1.0μL，1×H2.0μL，BSA2.0μL，滅菌超純水補至20μL，各組份混勻后，將其置于37℃水浴中2h；

4)通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定雙酶切效率，將質粒載體PcDNA3.1(+)和目的基因Fbw7全長進行連接，具體反應體系如下：

10×反應緩沖液1.0μL，PCDNA3.1(+)2.0μL，Fbw76.0μL，T4DNA連接酶1.0μL，各組份混勻后，16℃金屬浴中連接過夜；

5)將重組質粒轉化感受態細菌，篩選陽性克隆，并進行測序鑒定，如鑒定結果為陽性克隆，則抽提PcDNA3.1(+)-Fbw7重組質粒；

6)將步驟5)所述抽提的PcDNA3.1(+)‐Fbw7重組質粒進行DNA測序分析，選取雙向測序模式，使用PcDNA3.1(+)質粒通用引物橫跨質粒的多克隆位點區逐個堿基檢測，檢測結果與Fbw7序列進行比對。

3.如權利要求2所述PcDNA3.1(+)‐Fbw7重組質粒的構建方法，其特征在于在步驟5）中，所述測序鑒定的具體方法為：

用第1對引物進行菌落PCR擴增，對擴增后所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如所得DNA片段長度為244bp，則鑒定為陽性克隆，所述第1對引物為：

正向引物：5’-ctacccaaaagtaatcatcttaagtg-3’；

反向引物：5’-cccaaccatgacaagattttcc-3’；

用第2對引物進行菌落PCR擴增，對擴增后所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如所得DNA片段長度為278bp，則鑒定為陽性克隆，所述第2對引物為：

正向引物：5’-tttctgtttctccctctg-3’；

反向引物：5’-gagcatttaagggagagataagag-3’。

4.如權利要求2所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重組質粒的構建方法，其特征在于在步驟6)中，所述進行DNA測序分析是將步驟5)所述抽提的PcDNA3.1(+)-Fbw7重組質粒送至美國Invitrogen公司進行DNA測序分析。

5.如權利要求1所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重組質粒在制備治療人膽管癌藥物中的應用。

6.穩定轉染PcDNA3.1(+)‐Fbw7質粒的細胞株的建立方法，其特征在于其具體步驟為：

1)將帶新霉素抗性篩選的PcDNA3.1(+)‐Fbw7質粒用脂質體2000試劑轉染人膽管癌細胞株，轉染具體步驟如下：

(1)待細胞生長至密度為70%～90%時進行轉染，使用150μL的opti‐MEM稀釋3μg質粒；

(2)用150μL的opti‐MEM稀釋10μL的2000，然后室溫作用5min；

(3)5min后將步驟(1)中的混合液加至步驟(2)中的混合液，輕輕吹打混勻，室溫作用c；

(4)20min期間，將轉染的細胞用磷酸緩沖液漂洗一次，更換為無雙抗的培養基；

(5)20min后將上述混合的轉染液加入細胞左右搖勻；

(6)細胞培養兩天后檢測轉染效率并準備開始篩選工作；

2)轉染后，將人膽管癌細胞株消化后轉接到細胞培養皿中，培養液可為1640培養基；

3)在培養液中加入G418（新霉素類似物）進行篩選；篩選期間換培養液的間隔時間為3～4天；

4)將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100μg/ml～1mg/ml的G418濃度范圍內進行篩選，選擇出在10～14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗；

5)由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質，在轉染24h之后加G418篩選，每3～5天都要更換一次含有G418的篩選液，這時藥物濃度可以降至1000μg/mL；

6)挑選單克隆的優化，為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應用套環法或刮除法結合有限稀釋法來篩選陽性克隆；加藥后，在高倍鏡下刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續篩選培養；或則用套環套住陽性克隆，在套環內加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養，最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選；

7)經過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩定，外源基因沒有整合到基因組中的目的基因會導致表達的目的蛋白的量產生很大差異，隨著培養時間的延續，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據優勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少，經過2次以上的篩選之后得到強分泌目的蛋白，遺傳穩定的細胞克隆。