[發明專利]新型PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201310317554.X
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103789278A
• 公開（公告）日: 2014-05-14
• 發明（設計）人: 薛榮亮;黨莎杰
• 申請（專利權）人: 薛榮亮
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種融合蛋白，具體涉及一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白；本發明還涉及這種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法。?

背景技術

氧自由基是細胞正常代謝過程中產生的副產物，正常情況下，氧自由基的產生和清除基本平衡，當機體氧自由基生成明顯增多或抗氧化系統功能障礙時，堆積在體內的大量氧自由基會攻擊機體，造成氧化應激反應。超氧化物歧化酶(SOD)能夠催化超氧化物陰離子自由基(O₂^-·)發生歧化反應，從而有效地清除O₂^-，使細胞免受O₂^-·的氧化損傷。但由于自由基的產生和作用主要是在胞內進行的，任何外源的抗氧化劑都需要首先進入細胞，才能發揮其作用。所以SOD必須進入細胞內甚至是線粒體內才能起到抗氧化損傷的作用。然而SOD分子沒有特異性受體，很難直接穿過細胞膜，其臨床作用受到很大的限制。HIV-1編碼的反式激活蛋白(TAT)中的蛋白轉導結構域(PTD)是一種能夠把生理狀態下不能進入細胞發揮生物學效應的物質帶入細胞內的載體工具。現已證明PTD與其他蛋白融合表達，可以使生物大分子以非受體依賴方式進入細胞，且具有轉導蛋白廣譜以及外源蛋白質生物活性不受影響等優點。然而現有PTD存在轉導效率相對低下和潛在的細胞毒性等缺陷。針對此問題，現研究發現了一種新型的蛋白轉導結構域PTD4，其通過化學合成法把其中的3個精氨酸、2個賴氨酸和1個?甘氨酸均用丙氨酸(Ala)替換，使其a-螺旋結構更加穩定，核心序列是YARAAARQARA，PTD4肽在二級結構上是一個雙親結構，雙親結構的親水部分有利于精氨酸中帶正電荷的胍基和細胞表面結合，其疏水部分更有利于穿透細胞膜，被證明具有高于TAT-PTD?32倍的轉運蛋白質進入細胞內的效率。同時現有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制備方法并不成熟和完善，融合基因的構建、蛋白的分離及純化工藝過程復雜，尤其是誘導融合蛋白大量表達的條件眾說紛紜，并沒有摸索清楚。?

發明內容

本發明的主要目的是提供一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，利用PTD4的高穿膜功能和低細胞毒性將原本不能通過細胞膜的Cu，Zn-SOD轉導至細胞膜發揮生物學功能，解決現有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白存在的轉導效率相對低下以及潛在的細胞毒性問題。?

本發明的另一個目的是提供所述新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，解決現有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制備方法融合基因的構建、蛋白的分離和純化工藝過程復雜以及誘導融合蛋白表達量少的缺陷。?

本發明構建PTD4-Cu，Zn-SOD重組基因，該重組基因由PTD4基因、Cu，Zn-SOD基因設計合成。?

PTD4基因序列如SEQID?NO：1所示，具體序列如下：?

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Cu，Zn-SOD基因序列如SEQID?NO：2所示，具體序列如下：?

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