[發(fā)明專利]新型PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310317554.X
• 申請(qǐng)日: 2013-07-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103789278A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛榮亮;黨莎杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 薛榮亮
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/62;C12N15/70
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，編碼該融合蛋白的基因具有如SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。

2.如權(quán)利要求1所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括有以下步驟：

1)分別設(shè)計(jì)Cu，Zn-SOD特異性引物和PTD4寡核苷酸序列；

2)通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增Cu，Zn-SOD?cDNA片段；

3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物和pET16b載體分別經(jīng)雙酶切、膠回收后進(jìn)行連接反應(yīng)；

4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH10B大腸桿菌并提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定命名為pET16b-Cu，Zn-SOD質(zhì)粒；

5)將PTD4兩條寡核苷酸鏈煮沸復(fù)性；

6)分別雙酶切pET16b-Cu，Zn-SOD質(zhì)粒和煮沸復(fù)性的PTD4兩條寡核苷酸鏈，膠回收后進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH10B大腸桿菌并提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定命名為pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD質(zhì)粒；

7)將pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli?BL21(DE3)大腸桿菌中，然后加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白表達(dá)；

8)取經(jīng)溶菌酶加超聲裂解法處理誘導(dǎo)表達(dá)后菌體的上清溶液，利用Ni-NTA親和層析柱在天然條件下，依次加入咪唑結(jié)合緩沖液、咪唑漂洗緩沖液緩和咪唑洗脫緩沖液，純化PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白。

3.如權(quán)利要求2所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述Cu，Zn-SOD特異性引物包括如SEQ?ID?NO：4所示的上游引物以及如SEQ?ID?NO：5所示的下游引物，其中上游引物5′端加有Xho?I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引物5′端加有BamH?I限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，且含終止密碼子TTA。

4.如權(quán)利要求2所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，所述PTD4寡核苷酸序列包括如SEQ?ID?NO：6所示的正鏈以及如SEQ?ID?NO：7所示的負(fù)鏈，其中正鏈的5′端加有Nde?I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，且含起始密碼子ATG，負(fù)鏈的5′端加有Xho?I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

5.如權(quán)利要求3所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的Cu，Zn-SOD?cDNA片段和pET16b載體分別經(jīng)Xho?I和BamH?I限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切。

6.如權(quán)利要求4所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述pET16b-Cu，Zn-SOD質(zhì)粒和煮沸復(fù)性的PTD4兩條寡核苷酸鏈分別經(jīng)Nde?I和Xho?I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切。

7.如權(quán)利要求5或6所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli?BL21(DE3)中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)時(shí)，搖床震蕩頻率為160-220rpm/min、溫度20-37℃，IPTG終濃度為0.2-1.0mM，誘導(dǎo)時(shí)間1-6小時(shí)。

8.如權(quán)利要求7所述的一種新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述結(jié)合緩沖液咪唑濃度為10mM，漂洗緩沖液咪唑濃度為20mM，洗脫緩沖液咪唑濃度為50-500mM。