[發明專利]一種特異性快速檢測環腺苷酸的試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201310316937.5
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103376250A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 劉小龍;劉景豐;黃愛民;王毅婧
• 申請（專利權）人: 福州市傳染病醫院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 王利強

（一）技術領域

本發明涉及一種特異性快速檢測環腺苷酸的試劑盒及檢測方法。

（二）背景技術

環腺苷酸（cAMP）以微量存在于動植物細胞和微生物中，是一種具有細胞內信息傳遞作用的小分子，被稱為細胞內信使（intracellular?messenger）或第二信使（second?messengers）。cAMP參與調節細胞的生理活動與物質代謝等過程；具有調節神經遞質合成，促進激素分泌的作用；并可促使非神經細胞膜上某些蛋白的磷酸化，使其構型發生改變，從而調節膜的通透性；對離體細胞有抑制細胞分裂、促進分化的作用；同時，cAMP參與神經節突觸傳遞，在維持生物體的正常機能上有著無可替代的作用。cAMP作為最重要的分子在細胞的各種生理、病理過程中起著重要作用，可作為細胞活性的一個重要標志物。cAMP最早發現于肝臟勻漿中，隨后人們陸續在很多組織如腎、肺、腸、冠狀動脈、支氣管、腦垂體、血小板、乳汁、睪丸、骨髓等組織或體液中發現有cAMP存在，哺乳動物除紅細胞外，所有組織中均有分布。因此，通過監測細胞內cAMP含量的改變，可以評價多種藥物、生物制劑或生物活性物質對細胞以及生物體的影響。

早期cAMP檢測的方法有三種：競爭性蛋白質結合分析法、放射性免疫分析法和薄層色譜法。但由于放射性免疫分析法采用放射性核素標記，應用范圍受到一定限制。各種酶標記法和化學發光法的競爭性ELISA檢測試劑盒的根本原理都是基于抗體抗原的免疫反應，這些試劑盒中采用的抗體多是兔抗血清或者是經過特異親和提純之后的抗cAMP兔多抗，采用高效錨定cAMP多抗的酶標板，試劑盒內提供cAMP-HRP偶聯物，直接與待測樣本內cAMP競爭性的結合到酶標板的cAMP抗體上。通過測定HRP顯色底物等試劑在OD₄₅₀nm處的吸收值，從而測定cAMP的含量，這種方法雖然提高了檢測的靈敏度和安全性，但同時也存在特異性不高的缺陷。隨時科技技術的不斷進步，實時無標記動態細胞分析技術也逐步應用于cAMP含量檢測中，此技術通過特殊工藝，將微電子細胞傳感器芯片整合到細胞檢測板的底部，通過實時動態的電極阻抗檢測從而獲得細胞內cAMP含量等信息，但此方法存在成本較高，污染較大，需利用高靈敏度的儀器進行定量分析等弊端。

（三）發明內容

本發明目的是為了彌補上述現有技術的不足，提供一種特異性快速檢測cAMP的試劑盒及檢測方法。

本發明利用cAMP與其配體鏈的特異性結合原理，在能量共振轉移的基礎上，通過檢測熒光染料Cy3與熒光染料Cy5的熒光強度變化，從而對cAMP進行快速檢測；可以評價多種藥物、生物制劑或生物活性物質對cAMP合成的影響。本發明操作簡單，具有測試樣品量低、靈敏性高，檢測速度快等優點，可同時實現cAMP的體外及體內檢測。

本發明采用的技術方案是：

一種特異性快速檢測環腺苷酸的試劑盒，主要包括：Cy3熒光標記以及磷酸化修飾的cAMP適配體，Cy5熒光標記的cAMP適配體互補鏈；

所述cAMP適配體序列如下：

5’-ppp-ggaagagauggcgacUAAAACGACUUGUCGC-cy3-3’；

所述cAMP適配體互補鏈序列如下：

5’-cy5-GCGACAAG-3’。

上述為試劑盒主要試劑，不包括檢測過程中所用的溶劑（如cAMP檢測緩沖液）等常規試劑。

優選的，所述試劑盒還包括cAMP檢測緩沖液，組成如下：137mM?NaCl，2.7mM?KCl，2mM?KH₂PO₄，10mM?Na₂HPO₄，10mM?Tris-HCl，1mM?EDTA，20μM?IBMX，20μM?EHNA，20μM?Amrinone，20μM?Milrinone，20μM?Sildenafil，pH=8.0，溶劑為水。

本發明還涉及一種利用所述試劑盒檢測cAMP的方法，所述方法包括：

（1）分別配制濃度為0.2μM～1μM的cAMP適配體和cAMP適配體互補鏈溶液。

（2）將步驟（1）所得cAMP適配體溶液和互補鏈溶液按照摩爾比1:1的比例充分混合，得到適配體與互補鏈混合液，300rpm、25℃充分反應5min后，用552nm的激發光源激發，檢測520nm～720nm處的熒光檢測信號，所得數據作為檢測對照。