[發(fā)明專利]一種特異性快速檢測環(huán)腺苷酸的試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310316937.5
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN103376250A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發(fā)明（設計）人: 劉小龍;劉景豐;黃愛民;王毅婧
• 申請（專利權）人: 福州市傳染病醫(yī)院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 王利強

1.一種特異性快速檢測環(huán)腺苷酸的試劑盒，主要包括：Cy3熒光標記以及磷酸化修飾的cAMP適配體，Cy5熒光標記的cAMP適配體互補鏈；

所述cAMP適配體序列如下：

5’-ppp-ggaagagauggcgacUAAAACGACUUGUCGC-cy3-3’；

所述cAMP適配體互補鏈序列如下：

5’-cy5-GCGACAAG-3’。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括cAMP檢測緩沖液，組成如下：137mM?NaCl，2.7mM?KCl，2mM?KH₂PO₄，10mM?Na₂HPO₄，10mM?Tris-HCl，1mM?EDTA，20μM?IBMX，20μM?EHNA，20μM?Amrinone，20μM?Milrinone，20μM?Sildenafil，pH=8.0，溶劑為水。

3.利用權利要求1所述試劑盒檢測cAMP的方法，所述方法包括：

（1）分別配制濃度為0.2μM～1μM的cAMP適配體和cAMP適配體互補鏈溶液；

（2）將步驟（1）所得cAMP適配體溶液和互補鏈溶液按照摩爾比1:1的比例充分混合，得到適配體與互補鏈混合液，300rpm、25℃充分反應5min后，用552nm的激發(fā)光源激發(fā)，檢測520nm～720nm處的熒光檢測信號，所得數據作為檢測對照；

（3）取步驟（1）所得cAMP適配體溶液，加入梯度濃度的cAMP溶液，300rpm、25℃充分反應5min，按照cAMP適配體與cAMP適配體互補鏈摩爾比1:1的比例加入cAMP適配體互補鏈溶液，300rpm、25℃充分反應5min后，用552nm的激發(fā)光源激發(fā)，檢測波長在570nm和666nm的熒光發(fā)射強度，計算666nm/570nm熒光強度比值，以cAMP濃度的對數值為橫坐標、666nm/570nm熒光強度比值為縱坐標，繪制標準曲線；

（4）將待測樣品加入步驟（1）所得cAMP適配體溶液中；300rpm、25℃充分反應5min，按照cAMP適配體與cAMP適配體互補鏈摩爾比為1:1的比例加入cAMP適配體互補鏈溶液，300rpm、25℃充分反應5min后，用552nm的激發(fā)光源激發(fā)，檢測波長在570nm和666nm的熒光發(fā)射強度，計算666nm/570nm熒光強度比值，對照標準曲線，獲得待測樣品中cAMP濃度數據。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于配制所述cAMP適配體和cAMP適配體互補鏈溶液的溶劑為cAMP檢測緩沖液，組成如下：137mM?NaCl，2.7mM?KCl，2mM?KH₂PO₄，10mM?Na₂HPO₄，10mM?Tris-HCl，1mM?EDTA，20μM?IBMX，20μM?EHNA，20μM?Amrinone，20μM?Milrinone，20μM?Sildenafil，pH=8.0，溶劑為水。