[發明專利]利用原生質體轉化構建黑根霉CPR基因工程菌的方法

有效

• 申請號: 201310316876.2
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103695455A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 陳小龍;顧光志;朱廷恒;嘉曉勤;范永仙;沈寅初
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;臺州仙琚藥業有限公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C12N1/14;C12R1/845
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種利用原生質體轉化構建黑根霉CPR基因工程菌的方法。?

（二）背景技術

黑根霉（Rhizopus?nigricans）對甾體具有C11α-羥基化反應能力。羥基化生物轉化反應通常是P450酶系介導的，細胞色素P450氧化還原酶（NADPH-cytochrome?P450reductase，CPR，E.C.1.6.2.4）能將電子從NADPH傳遞到細胞色素P450、細胞色素c、細胞色素b5以及血紅素氧化酶等血紅素蛋白。?

目前，改進生物轉化體系的方法大體可歸納為三類：增加底物溶解性，解除底物（產物）抑制，改變細胞膜（細胞壁）通透性，已遇到一程度上的瓶頸。隨著分子技術水平的發展，將P450單加氧酶（CYP）和P450還原酶（CPR）基因在酵母或大腸桿菌等模式菌株中進行克隆表達，在轉錄水平調控、酶活分析、藥物代謝等方面不斷邁向新的領域。但關于構建黑根霉CPR基因工程菌并應用于甾體羥化轉化上的應用未見報道。?

自1973年首先在粗糙脈胞菌建立DNA轉化系統，1983年建立構巢曲霉DNA轉化系統以來，迄今已在30多種絲狀真菌中建立了DNA轉化系統。絲狀真菌遺傳轉化方法包括電擊轉化法、基因槍轉化法、農桿菌介導轉化法、原生質體轉化法、醋酸鋰轉化法等。并已成功應用于赤霉菌、毛霉、綠色木霉等絲狀真菌中。但尚未有采用原生質體轉化法應用于黑根霉的報道。?

（三）發明內容

本發明目的是提供一種利用PEG-CaCl₂介導原生質體轉化技術構建黑根霉CPR基因工程菌的遺傳轉化方法，并找到轉化效率高的轉化參數組合，可用于黑根霉工程菌育種以及分子生物學研究等領域，并為其他絲狀真菌遺傳轉化提供借鑒。?

本發明采用的技術方案是：?

一種利用原生質體轉化構建黑根霉CPR基因工程菌的方法，所述方法包括：?

（1）從米根霉克隆得到其CPR基因，克隆至質粒pCB1004-pgpd，得?

到表達質粒pCB1004-pgpd-CPR；?

具體步驟如下：根據NCBI數據庫上所報道的米根霉CPR基因序列設計引物，并根據pCB1004-pgpd質粒上的MCS序列選出適合的酶切位點，然后提取米根霉總RNA，利用RT-PCR擴增得到CPR目的基因片段；經過T-A克隆，得到重組子經測序正確后，用限制性內切酶酶切得到目的片段并將其克隆至pCB1004-pgpd上MCS上相應的酶切位點，轉化至大腸桿菌得到重組子并測序；測序正確后，從大腸桿菌中提取pCB1004-pgpd-CPR質粒，備用。?

目前真菌絕大多數用潮霉素篩選，所述的pCB1004-pgpd質粒上的潮霉素（hygromycin）抗性基因（hph）由Aspergillus?nidulans的ptrpC啟動子調控，MCS序列上游由強啟動子pgpd?A調控；?

（2）將黑根霉孢子原生質體用1mol/L的山梨醇溶液懸浮，調節原生?

質體濃度為10⁷～10⁸個/mL，得到原生質體溶液；所述山梨醇溶?液組成如下：1mol/L山梨醇，10mmol/L?Tris-Cl，CaCl₂50mmol/L，溶劑為水，pH7.0；所述米根霉和黑根霉采用常規市購菌株即可；?

（3）將構建的表達質粒pCB1004-pgpd-CPR經限制性內切酶酶切，酶切產物純化后溶于無菌去離子水至濃度為10～15μg/mL，得到線性化質粒溶液；?

（4）每100μL原生質體溶液加入10μL線性化質粒溶液，并加入1～2μL步驟（3）所述限制性內切酶，混勻，冰浴30min后，加入20～50μL的PEG4000-CaCl₂溶液，冰浴10～20min；再加入400～800μL的PEG4000-CaCl₂溶液，室溫靜置10～15min；所述PEG4000-CaCl₂溶液終濃度組成如下：PEG400060%，CaCl₂50mmol/L，1mol/L山梨醇，Tris-Cl10mmol/L，pH7.0，溶劑為水；?

（5）步驟（4）轉化液轉移至10mL?MYG液體再生培養基，28℃、80rpm，培養12h后，離心，用無菌去離子水洗滌，獲得菌懸液涂布于含有150μg/mL潮霉素B的MYG固體平板，28℃培養；?