[發(fā)明專利]利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建黑根霉CPR基因工程菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310316876.2
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103695455A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳小龍;顧光志;朱廷恒;嘉曉勤;范永仙;沈寅初
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué);臺州仙琚藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C12N1/14;C12R1/845
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化構(gòu)建黑根霉CPR基因工程菌的方法，所述方法包括：

（1）從米根霉克隆得到其CPR基因，克隆至質(zhì)粒pCB1004-pgpd，得到表達質(zhì)粒pCB1004-pgpd-CPR；

（2）將黑根霉孢子原生質(zhì)體用1mol/L的山梨醇溶液懸浮，調(diào)節(jié)原生質(zhì)體濃度為10⁷～10⁸個/mL，得到原生質(zhì)體溶液；所述山梨醇溶液組成如下：1mol/L山梨醇，10mmol/L?Tris-Cl，50mmol/L?CaCl₂，溶劑為水，pH7.0；

（3）將構(gòu)建的表達質(zhì)粒pCB1004-pgpd-CPR經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物純化后溶于無菌去離子水至濃度為10～15μg/mL，得到線性化質(zhì)粒溶液；

（4）每100μL原生質(zhì)體溶液加入10μL線性化質(zhì)粒溶液，并加入1～2μL步驟（3）所述限制性內(nèi)切酶，混勻，冰浴30min后，加入20～50μL的PEG4000-CaCl₂溶液，冰浴10～20min；再加入400～800μL的PEG4000-CaCl₂溶液，室溫靜置10～15min；所述PEG4000-CaCl₂溶液組成如下：PEG400060%，CaCl₂50mmol/L，山梨醇1mol/L，Tris-Cl10mmol/L，溶劑為水，pH7.0；

（5）步驟（4）轉(zhuǎn)化液轉(zhuǎn)移至10mL?MYG液體再生培養(yǎng)基，28℃、80rpm，培養(yǎng)12h后，離心，用無菌去離子水洗滌，獲得菌懸液涂布于含有150μg/mL潮霉素B的MYG固體平板，28℃培養(yǎng)；

（6）待平板上長出菌絲后，轉(zhuǎn)接到含有150μg/mL潮霉素B的MYG固體平板上；轉(zhuǎn)化子在潮霉素B濃度200μg/mL的MYG固體平板上繼代培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子基因組，進行PCR確定目的基因片段是否整合到黑根霉基因組中，鑒定正確后保存。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述黑根霉孢子原生質(zhì)體溶液按如下方法制得：

（1）收集黑根霉菌絲，用無菌去離子水洗滌2次后，再用酶解液洗滌2次，得濕菌體；所述酶解液組成如下：0.5mol/L?MgSO₄，50mmol/L?DL-Maleate?aicd，溶劑為水；

（2）每1ml細胞壁降解酶液加入0.5～1.0g濕菌體，置30℃水浴鍋，每20min輕輕搖勻，酶解游離原生質(zhì)體3～4h，得到原生質(zhì)體酶解液；細胞壁降解酶液按如下組成配制：lywallzyme和Yatalase質(zhì)量比為5:7的混合酶溶解于無菌的0.5mol/L?MgSO₄、50mmol/L?DL-Maleate?aicd溶液中，制成終濃度為50mg/mL的細胞壁降解酶液；

（3）將原生質(zhì)體酶解液用1mol/L山梨醇溶液稀釋，過濾除去菌絲殘片，5000r/min離心10min，得原生質(zhì)體沉淀，用1mol/L山梨醇溶液懸浮，調(diào)節(jié)原生質(zhì)體濃度為10⁷～10⁸個/mL，得原生質(zhì)體溶液。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述CPR基因序列如下：

ATGACTCGAAACAACTCTCATCATCTGCTTGACACAGTCGATTTGATACTGCTAGGTACCATTGGCCTTGGTACAGTTGCTTGGTTTGCTAGACATCAAATAGCCAATCGACTTTTCAAATCTGATTCTACCAATAAATCTGAAGTTAAGGATGAGGCAAAGACCCCTAAACAAGAACGTAACTTTGTTAAAGTGATGCAGCAACAGGGTCGTCGAGTCATCTTCTTTTATGGTTCTCAGACAGGTACAGCCGAAGACTTTGCTTCTCGTCTTGCAAAAGAATGTACACAAAAATATGGTGTGAGCGCAATGACTGCTGATATTGAACAATATGATTTGAGCTACCTTGATTCAGTTCCCGAAGACTCTTTGGTGTTCTTTATTATGGCAACCTATGGTGAAGGTGAACCTACTGATAACGCTGTTGATTTTTGGGACTTGTTAGCAGAAGAGGTACCTGAGTTCTCTAATGATGATGGTGAGGGAAAGCCATTGCAAAAACTTCGTTATGTAGCCTTTGGTCTTGGTAACAAAACTTATGAGCATTACAATGAGGTCATTAGAAAAGTAGATAACCGTTTACTTTCTTTGGGTGCAAAGAGAATCGGCGAAAGAGGAGAAGGTGATGATGATGGTACACTTGAAGAAGATTTCTTGGCTTGGCAAGAAGAGATGTGGCCTGCTTTTTGTGAAGCTCTTGGTGTAGATGAAAGCAATGCTCACTCTGGACCACGCCAAGCTATTTTCAAAATCGAAGAACTGACTGCATATGACCAAGCAAAGGTCTACCTTGGTGAAATAGGAGAATGGCTTAAGGAAGGAGCCTCTATTGTTTATGATGCTAAACGTCCTTACAATGCACCTATTACTTCAAAGGACATTTTCAAAGCAGGCGATAGACATTGTCTTCATCTTGAAATTGATATTTCTAATACAAACTTGTCTTATCAAACTGGTGACCATGTTGCTATTTGGCCAACAAACAATGAAGTCGAAGTCAACCGTCTTGCTAAACTTCTTGGATTACAAAATAAGTTGGATACAGTCATTCACGTACAATCACTTGACCCTGCTGCTTCCAAAAAATATCCTTTCCCAGTTCCTACAACCTATCGAGCTGTATTCCGTCATTACCTTGACATTTGTTCTGCAGTTCCCCGTCAAGTCTTGATGTCATTGATTGAATATGCTCCTACTGAAGCCTCCAAAGAAGCTCTTAGAAAACTTGCTACTGATAAAGATGAATATCGTGTTCATGTAGGTGATGTCACTCGTAACTTGGGTGAGGTATTACAAATGTTGGCAGAGAGTGAATCTTTGGAGTTAGATGGTGCATTTTCCTCAGTTCCTTTCGATTTAGTTATTGAAAGCATCTCACGTCTTCAACCTCGCTACTACTCCATTTCTTCATCATCAAAAGAAAATCCCAAAAAGATTGCCGTTACTGCAGTCACTCTTCAATACACTCCAGAGCACGGATCTCCTCGTACAGTCTATGGTGTTAATACCAACTATCTTTGGCGTGTTCATGAAGCAGTCAATAACTTAACTCCTAATAGTGTGATCCCTGAATATAACTTGACAGGACCACGTGATTCATTGTTTAGCCAGCAAGGCAAAGTTGCTCGTATTCCTGTTCATGTCCGTCGTTCTCAATTCAAATTGCCTAGAAATCCTACTGTGCCTGTTATCATGATCGGTCCTGGTACTGGTGTTGCACCATTCCGTGGATTTGTTAGAGAACGCGCACTTCAAAAGAAGGAAAATAAACCAGTGGGGCCTACTATCCTCTTCTTTGGTTGTCGTAATAGAGCAGAAGATTTCCTTTATGAAGAAGAATGGCCAGAGTTATTTGAAGTCTTGGGAGGTGATTCTCGTATCATCACAGCATTTTCACGTGAAACTGAAAAAAAGGTTTATGTACAACACCGCTTAATGGAAAATGGCCAAGAGATGTGGAATTTATTGGAAAAGGGCGCTTACGTTTATGTTTGTGGAGATGCAAAGAACATGGCTCGTGATGTTAATCAAACATTTGTACGCTTTGCACAACAGTTTGGCGGAATGGACGAAAATCGATCTCAGGATTACGTGAAGAATTTGAGAAATACGGGTAGATACCAAGAAGATGTTTGGAGTTAA。