[發明專利]三疣梭子蟹C-型凝集素基因多態性標記及SNP分子標記基因分型的方法

有效

• 申請號: 201310315502.9
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103387978A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 郝貴杰;王春琳;沈錦玉;母昌考;潘曉藝;林鋒;李榮華;盛鵬程;姚嘉赟;徐洋
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及三疣梭子蟹C-型凝集素基因組及其抗溶藻弧菌相關的SNP分子標記的制備，以及快速進行SNP基因分型的方法，屬于水產生物技術中的分子標記育種技術領域。

背景技術

三疣梭子蟹(Portunus?trituberculatus)是大陸沿海各省海水養殖的主導產品，尤其是浙江。我國養殖的梭子蟹有三分之二是在浙江，在“十二五規劃”中，三疣梭子蟹被列為寧波水產養殖三大主導產品之一。然而，近年來，由于養殖規模的不斷擴大、養殖環境的污染等損害了三疣梭子蟹免疫防御系統，導致自身的抗病力下降，對病害的易感性增加，疾病頻繁發生。溶藻弧菌(Vibrio?alginolyticus)的感染給三疣梭子蟹養殖業帶來了重大經濟損失，嚴重制約了梭子蟹養殖業的持續健康發展。

目前，養殖戶多用抗生素進行病害的防治，但從使用抗生素等藥物的安全性、抗藥性以及對水環境的不良影響等方面考慮，研究三疣梭子蟹的免疫機制，篩選與抗病相關的分子標記用來人工輔助育種，培育優良的抗病品系，顯得越來越重要。三疣梭子蟹屬于甲殼類動物，無特異性免疫應答，非特異性免疫包括細胞免疫和體液免疫，C-型凝集素是甲殼類動物體液免疫中重要的免疫因子之一。其表面攜帶有特異性糖基決定簇的受體，能依據顆粒物質表面的糖基組成來區分異己，它的作用類似于脊椎動物的抗體，選擇性凝集外來病原菌和復雜的碳水化合物，調理和介導血細胞吞噬外來物質，協同其他免疫因子抵御外來病原入侵。

目前國內外對三疣梭子蟹的免疫相關基因的研究尚處于初級階段，僅是得到了基因cDNA的全長及其分子結構特征以及病原刺激后該基因的表達特征等，初步闡明了該基因在機體抗感染中的積極應答。但其多態性與三疣梭子蟹抗病性狀的關系研究還未見報道。

單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphisms，SNPs)標記是指基因組序列單個核苷酸差異而引起的遺傳多態性，包括單個堿基的轉換、顛換以及單個堿基的插入、缺失等。它作為一類遺傳標記以其位點豐富、具有代表性、遺傳穩定性高及易實現分析的自動化等特性得以廣泛應用。

高分辨率熔解曲線(High?Resolution?Melting，HRM)技術是近年來興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。該方法與其他遺傳分型技術相比，不受突變堿基位點與類型的局限，操作簡便，具有靈敏性、特異性高、成本低廉、快速、高通量檢測的優點，結果準確，并且實現了真正的閉管操作。HRM技術主要是根據核酸分子熔解溫度和熔解形狀的不同來區分樣品，在PCR反應時引入飽和的熒光染料EvaGreen或LC?Green?plus，熒光染料在PCR擴增的過程中被嵌入到DNA雙鏈中。當嵌有染料的DNA分子解鏈的時候，儀器對熒光信號進行采集，繪制出DNA分子的熔解曲線，不同的樣品由于堿基作用力的不同呈現出不同的熔解曲線形狀及熔解溫度(Tm值)。如果采用高分辨率的儀器進行檢測，并用專門的軟件進行分析，微小的差別就會被檢測出來，從而能夠成功的篩選出突變基因或進行基因分型。

因為HRM技術具有較多的優點，被廣泛應用于醫學分子分型診斷及甲基化研究中，近年來，也被逐步用于水產生物技術及分子育種領域中，但目前尚未有將HRM技術用于三疣梭子蟹SNP分子標記基因分型的報道。

發明內容

針對現有技術中有關三疣梭子蟹分子標記研究的不足，申請人深入開展了三疣梭子蟹C-型凝集素基因的多態性及抗病相關SNP的篩選，并將HRM技術應用于抗病相關的SNP分子標記基因分型的研究，本發明的研究成果可用于利用標記輔助選擇(MAS)選擇有利的基因型個體作為親本，為培育三疣梭子蟹抗病品系奠定重要的基礎。

基于上述研究，本發明的第一個目的是獲得三疣梭子蟹C-型凝集素基因組DNA及其多態性，并篩選出抗病相關的分子標記，為培育三疣梭子蟹抗病品系提供基因標記。

本發明的第二個目的是建立快速檢測抗病相關SNP的高分辨率溶解曲線(HRM)的方法，為利用標記輔助選擇(MAS)進行選擇抗病基因型個體作為親本培育三疣梭子蟹抗病品系奠定基礎。

為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的：

本發明公開了三疣梭子蟹C-型凝集素基因多態性標記(SNP)，該基因多態性標記包括三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列的4個SNP位點及一個三堿基的缺失，其中第四外顯子205bp處的SNP與三疣梭子蟹溶藻弧菌易感性/抗性相關聯，命名為T/C?E4-205。