[發明專利]三疣梭子蟹C-型凝集素基因多態性標記及SNP分子標記基因分型的方法

有效

• 申請號: 201310315502.9
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103387978A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 郝貴杰;王春琳;沈錦玉;母昌考;潘曉藝;林鋒;李榮華;盛鵬程;姚嘉赟;徐洋
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.三疣梭子蟹C-型凝集素基因多態性標記，其特征在于該基因多態性標記包括三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列的4個SNP位點及一個三堿基的缺失，其中第四外顯子205bp處的SNP與三疣梭子蟹溶藻弧菌易感性/抗性相關聯，命名為T/C?E4-205。

2.用于得到三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相關的C-型凝集素分子標記的方法，其特征在于包括下述步驟：(1)克隆三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列；(2)制備三疣梭子蟹的抗病群體和敏感群體；(3)篩選抗病相關C-型凝集素基因標記。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)提取三疣梭子蟹血液樣品中的總基因組DNA，設計引物，利用長片段PCR擴增基因組DNA獲得序列，克隆至T載體后測序，獲得全長的C-型凝集素基因組，該序列為序列表序列1。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于擴增引物為F1、R1，序列為F1：5’TCCTGTTCTGACAACCACCAA3’；R1：5’CTGTGCCCGAGTCAAGAAGTA3’。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(2)采用溶藻弧菌對三疣梭子蟹進行浸泡感染，根據死亡時間判斷梭子蟹對病原菌感染的抵抗能力，將梭子蟹分為抗病群體和敏感群體。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)對步驟(2)所得個體的克隆進行測序，得到四個SNP位點：分別位于第二內含子、第三內含子、第三內含子、第四外顯子；對包含SNP位點序列設計引物擴增測序，并對各基因型及等位基因做相關性分析，將第四外顯子205bp處CC作為疾病敏感相關的C-型凝集素基因標記，將第四外顯子205bp處TT作為抗病相關的C-型凝集素基因標記。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于擴增SNP位點的引物分別為F2，R2；F3，R3；F4，R4，序列為F2：5’TCAAATCATTTCCTTGTGAGGG3’，R2：5’ACAAAAGGATGTCACCGTAGAA3’；F3：5’GCAATTCTACGGTGACATCCTT3’，R3：5’TTATCGCCATAGTTAGCCCAAA3’；F4：5’ACTCCTTTTTGGGCTAACTATGGC3’，R4：5’TCCAAAGTAAGCTGGTTAGCACAT3’。

8.用于三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相關聯的SNP基因分型的方法，其特征在于基于高分辨率熔解曲線分析技術的PCR-HRM快速進行，具體包括下述步驟：(1)提取三疣梭子蟹血液樣品中的基因組DNA，全部樣品統一為一個濃度；(2)供試樣品模板DNA進行PCR擴增，引物F5和R序列為F5：5’AAATGCCTACTGGAGGAGAGAAACA3’，R5：5’TTTCCTCGTTACTTCTCACAAATCG3’；(3)采用熒光定量PCR儀進行PCR擴增，并進行HRM分析，同時監測每一步的熒光信號獲得不同型別的DNA雙鏈的熔解曲線；(4)分析HRM結果，比較已知基因型樣品和待測基因型樣品的標準視圖和差異視圖，對待測樣品進行SNP分型。

9.根據權利要求8的方法，其特征在于所述步驟(3)PCR擴增程序為98℃預變性2min，40個擴增循環(98℃5sec，58℃20s)，HRM分析方法為溫度從65℃逐漸升高至85℃，每次升溫0.1℃，同時監測每一步的熒光信號獲得不同型別的DNA雙鏈的熔解曲線。

10.權利要求8的方法在選擇三疣梭子蟹抗病基因型個體作為親本培育三疣梭子蟹抗病品系中的應用。