[發明專利]含有一個或幾個點突變的洛伐他汀酰基轉移酶

有效

• 申請號: 201310315499.0
• 申請日: 2013-07-26
• 公開（公告）號: CN104342416B
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 李鶴;余允東;祝俊;吳會廣;黃學川;辛有英;任麗梅;成志遠;王翠;杜會云
• 申請（專利權）人: 石藥集團中奇制藥技術(石家莊)有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/81;C12N1/19;C12P17/06;C12R1/84
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本發明涉及一種洛伐他汀酰基轉移酶突變體，所述突變體在SEQ ID NO.1的野生型土曲霉（A.terreus）酰基轉移酶氨基酸序列基礎上包含選自N45R、A110P、S145N、Q230M、L293M、L379M中的任意二至六個氨基酸突變。本發明還涉及編碼所述突變體的核酸，相關表達載體和宿主細胞以及所述突變體合成辛伐他汀的用途。

技術領域

本發明涉及藥物生產領域，具體涉及辛伐他汀生產及其生產用酶，更具體涉及洛伐他汀酰基轉移酶及其在辛伐他汀生產中的應用。

背景技術

辛伐他汀是目前國內外最暢銷的降脂藥之一，可用于控制血液中膽固醇含量及預防心血管疾病，其藥理作用是作為競爭性抑制劑抑制膽固醇合成的限速酶：３-羥基-３-甲基戊二酰輔酶Ａ還原酶的活性，從而降低膽固醇的生物合成。作為洛伐他汀的半合成衍生物，與相同劑量的洛伐他汀相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇。

正是由于辛伐他汀具有重要醫學意義，許多科研院所及藥企開始專注于從洛伐他汀到辛伐他汀的多步反應的研究中，如PCT專利WO2005066150中，使用以水解洛伐他汀的C8酯產生三元醇莫那可林酸開始，接著選擇性甲硅烷基化C13醇，用二甲基丁酰氯酯化C8醇并去保護產生辛伐他汀酸：

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但近來由于對環境保護的倡導及綠色化學概念的提出，使人們把研究目光從能耗大并且毒性大的化學法生產辛伐他汀逐步重新轉向能耗低毒性低的酶法生產。

WO9426920研究了使用脂肪酶和酯酶作為酯化劑去合成辛伐他汀，但是由于區域選擇性酯化的要求使得必須進行其他醇基的保護，導致總產量的降低。因此，找到能夠選擇性酰化莫那可林酸的特效酶制劑對于有效合成辛伐他汀起到至關重要的作用。

US2009191602 (A1)報道了土曲霉的洛伐他汀生物合成的基因簇，該基因簇編碼的一個46KDa的蛋白質(SEQ ID NO.1)，即洛伐他汀酰基轉移酶（LovD），它可將酰基硫酯的酰基基團區域選擇性酰基化莫那可林酸C8羥基，為生物合成辛伐他汀的有效酶制劑：

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目前雖然研究人員經分離純化并克隆表達出天然存在的LovD，但天然存在的LovD仍有很多方面不盡如人意，如酰化酶活的效率不高等問題。高雪研究了LovD的86、12、190、275、26、161等位點的定點突變，其突變體有效的改進LovD的活性，溫度穩定性以及可溶性（Gao Xue; Xie Xinkai等，Directed evolution and structural characterization ofa simvastatin synthase，Chemistry & biology，2009,16(10):1064~1074）。Xie Xinkai等對LovD的突變體C40A/C60N在E.coli YT2中表達進行了研究（Xie Xinkai; PashkovInna等， Rational improvement of simvastatin synthase solubility inEscherichia coli leads to higher whole-cell biocatalytic activity，Biotechnology and bioengineering，2009,102(1):20~28）。WO2011041231(A1)中以4，9，26，28，35，40等20多個位點作為可選突變位點，得到了比單個突變提高的酰化酶活性的突變體。WO2011044496(A2)中變體LovD多肽包含在下列氨基酸殘基位置處的某氨基酸取代：A10、D12、K26、A86、A190、H161、K227、G275、V334或L361。華東理工的朱麗平為提高E.coliBL21菌株中的酰基轉移酶LovD的表達，從多個方面對發酵培養基和發酵條件進行優化，同優化前使用LB培養基相比，其酶活提高了將近5倍。