[發明專利]一種優質太平洋牡蠣精子的采集及超低溫冷凍保存的方法

有效

• 申請號: 201310314722.X
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN104336004A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 劉建國;李軍;許飛;張國范;李莉;韓龍江
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;A61D19/02;A01K61/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明屬海洋生物技術領域，具體地說是一種優質太平洋牡蠣精子的采集及冷凍保存的方法。

背景技術

太平洋牡蠣(Crassostrea?gigas)隸屬于牡蠣科，巨蠣屬，俗稱真牡蠣，是牡蠣類中個體較大的一種貝類。其肉質細嫩，味道鮮美，營養豐富，含蛋白質45%～57%、脂肪7%～11%、肝糖19%～38%，碘的含量高于牛奶和雞蛋，此外，還含有多種維生素及微量元素，有海洋牛奶之美稱。20世紀80年代從日本、澳大利亞和臺灣地區引入中國。貝類精液的超低溫保存在水產養殖、遺傳育種以及種質資源保存中具有重要的意義。太平洋牡蠣多采用解剖法人工授精，對優質雄性牡蠣要求較高，雄性親貝精子的質量嚴重制約了太平洋牡蠣的養殖繁育。除此之外,太平洋牡蠣精子的超低溫冷凍保存是太平洋牡蠣在家系的構建過程雄性親本留種的一個最為重要和可靠的方法。采用超低溫冷凍保存的方法可以在雄性太平洋牡蠣性腺發育最佳時期，將優質的的親貝的精子進行批量冷凍長期保存，在需要的時候隨時解凍進行人工授精。同時超低溫保存可以使精子的長距離運輸得以實現，有利于貝類的雜交、選育、優良形狀的獲得以及基因多樣性的保護。因此，建立太平洋牡蠣精子大容量超低溫保存的可靠方法對海水養殖業的發展以及生物多樣性的保護具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種優質太平洋牡蠣精子的采集及超低溫冷凍保存的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種優質太平洋牡蠣精子的采集：

a)將性腺發育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進行光照刺激，使雄性親本開始排精，收集精子，待用；

b)將上述采集的精子經篩絹網過濾，收集活力高于80%的精子。

所述步驟a)選擇殼長8-10cm性腺發育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進行暫養,而后撈出置于陽光下暴曬1-1.5小時，照射后翻轉到另一面再暴曬1-1.5小時后放入18-20℃自然海水中，待雄性牡蠣開始排精后立即從水中將其取出。

所述步驟b）將采集的精子用100-120目篩絹網過濾，收集活力高于80%的精子。

一種優質太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，

a)將經篩絹過濾的活力高于80%的精子中加入抗凍液，于0-4℃孵育；其中精液與抗凍液按1:4-1:6(V/V)的比例混合；

b)精子于抗凍液中孵育后，分裝置2ml-5ml凍存管中，在程序降溫儀中經孵育、兩步降溫、平衡，然后從程序降溫儀中取出，直接投入到-196℃的液氮，長期保存。

所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；稀釋液的配方為：NaCl：8g/L，KCl:0.8g/L，Na₂HPO₄·2H₂O:0.1g/L，KH₂PO₄:0.1g/L，NaHCO₃:0.35g/L；抗凍劑：10-12%（V/V）DMSO（二甲基亞砜）和3-4%PG（丙二醇）（以稀釋液作為基準的體積比）；添加劑：葡萄糖:10g/L，海藻糖170g/L。

所述冷凍保存步驟a)將經篩絹過濾收集的活力高于80%的精子中加入抗凍液，用力顛倒震蕩離心管5-10次，靜置2-3min，將靜置后的上層精子與抗凍液的混合液體倒出，通過100-120目篩絹網過濾，濾液待用；濾出的較大的組織塊輕輕擠壓，使組織塊中殘留精子釋放出來，然后用抗凍液沖洗篩絹網及殘余組織2-3次，將其與上述濾液合并，最后補充抗凍液使精子與抗凍液的比列維持在1:4-1:6，而后于0-4℃孵育20-30min。

所述冷凍保存步驟b)精子與抗凍液混合后置于程序降溫儀中在0-4℃下孵育20-30min，而后以-10--15℃/min的速率降溫至-60--80℃，然后再以-20--25℃/min的速率降溫至-150--180℃，平衡2-5分鐘，從程序降溫儀腔體中取出，直接投入到液氮（-196℃），分裝保存。

所述冷凍保存的精子解凍是將凍存管直接放入30-40℃水浴，置于室溫，震蕩20-30s，然后置于0-4℃冰箱中保存，待用。

所述冷凍保存的優質太平洋牡蠣凍精解凍時，直接放入30-40℃水浴100-120s，期間不斷搖動凍存管，然后放置于振蕩器室溫震蕩30s至完全融化，自然海水激活。

本發明具有如下優點：

1.本發明采集精子是采用暴曬刺激，等待牡蠣排精的時刻，解剖性腺，可獲得大量的高活力的優質精子；