[發明專利]一種優質太平洋牡蠣精子的采集及超低溫冷凍保存的方法

有效

• 申請號: 201310314722.X
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN104336004A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 劉建國;李軍;許飛;張國范;李莉;韓龍江
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;A61D19/02;A01K61/00
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

1.一種優質太平洋牡蠣精子的采集，其特征在于：

a)將性腺發育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進行光照刺激，使雄性親本開始排精，收集精子，待用；

b)將上述采集的精子經篩絹網過濾，收集活力高于80%的精子。

2.按權利要求1所述的優質太平洋牡蠣精子的采集，其特征在于：所述步驟a)選擇殼長8-10cm性腺發育成熟、飽滿的太平洋牡蠣進行暫養,而后撈出置于陽光下暴曬1-1.5小時，照射后翻轉到另一面再暴曬1-1.5小時后放入18-20℃自然海水中，待雄性牡蠣開始排精后立即從水中將其取出。

3.按權利要求1所述的優質太平洋牡蠣精子的采集，其特征在于：所述步驟b）將采集的精子用100-120目篩絹網過濾，收集活力高于80%的精子。

4.一種優質太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：

a)將經篩絹過濾的活力高于80%的精子中加入抗凍液，于0-4℃孵育；其中精液與抗凍液按1:4-1:6(V/V)的比例混合；

b)精子于抗凍液中孵育后，分裝置2ml-5ml凍存管中，在程序降溫儀中經孵育、兩步降溫、平衡，然后從程序降溫儀中取出，直接投入到-196℃的液氮，長期保存。

5.按權利要求4所述的優質太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：所述抗凍液由稀釋液、抗凍劑、添加劑三部分組成；稀釋液的配方為：NaCl：8g/L，KCl:0.8g/L，Na₂HPO₄·2H₂O:0.1g/L，KH₂PO₄:0.1g/L，NaHCO₃:0.35g/L；抗凍劑：10-12%（V/V）DMSO（二甲基亞砜）和3-4%PG（丙二醇）；添加劑：葡萄糖:10g/L，海藻糖170g/L。

6.按權利要求4所述的優質太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：

所述步驟a)將經篩絹過濾收集的活力高于80%的精子中加入抗凍液，用力顛倒震蕩離心管5-10次，靜置2-3min，將靜置后的上層精子與抗凍液的混合液體倒出，通過100-120目篩絹網過濾，濾液待用；濾出的較大的組織塊輕輕擠壓，使組織塊中殘留精子釋放出來，然后用抗凍液沖洗篩絹網及殘余組織2-3次，將其與上述濾液合并，最后補充抗凍液使精子與抗凍液的比列維持在1:4-1:6，而后于0-4℃孵育20-30min。

7.按權利要求4所述的優質太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：

所述步驟b)精子與抗凍液混合后置于程序降溫儀中在0-4℃下孵育20-30min，而后以-10--15℃/min的速率降溫至-60--80℃，然后再以-20--25℃/min的速率降溫至-150--180℃，平衡2-5分鐘，從程序降溫儀腔體中取出，直接投入到液氮（-196℃），分裝保存。

8.按權利要求4所述的優質太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：

所述冷凍保存的精子解凍是將凍存管直接放入30-40℃水浴，置于室溫，震蕩20-30s，然后置于0-4℃冰箱中保存，待用。

9.按權利要求8所述的優質太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：

所述冷凍保存的優質太平洋牡蠣凍精解凍時，直接放入30-40℃水浴100-120s，期間不斷搖動凍存管，然后放置于振蕩器室溫震蕩30s至完全融化，自然海水激活。