[發(fā)明專利]利用電荷排斥作用制備同二聚體蛋白混合物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310313763.7
• 申請(qǐng)日: 2013-07-25
• 公開（公告）號(hào): CN103388013A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐霆;須濤;汪皛皛;孫興魯;范英;曾燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C07K16/00
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 劉向昕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及制備同二聚體蛋白混合物的方法，具體涉及利用電荷排斥作用制備同二聚體蛋白混合物的方法。本發(fā)明還涉及利用所述方法制備得到的同二聚體蛋白混合物，以及所述方法制備同二聚體蛋白混合物的用途。

背景技術(shù)

單克隆抗體藥物在近十五年內(nèi)增長迅速，成為制藥行業(yè)的成長點(diǎn)。自1996年起，一共有30個(gè)左右單抗藥物被批準(zhǔn)上市。其中有九個(gè)單抗藥物年銷售超過十億美元。2010年單抗藥物總銷售超過300億美元，并且年增長率超過10%。由于單克隆抗體的靶標(biāo)特異性強(qiáng)，只能抑制單一靶點(diǎn)。而在腫瘤、自體免疫等多種疾病中，需要抑制多重信號(hào)通路來避免代償效應(yīng)。對(duì)于病毒感染疾病，由于病毒的高突變率，往往需要抑制多抗原位點(diǎn)來防止逃逸。因此，有以下幾種備選方案可以解決此類問題。一種備選方案是使用多克隆抗體，或通過改造抗體Fc段獲得異二聚體如雙特異抗體。還有一種方案是使用抗體混合物來治療，抗體混合物可包含兩種或更多種針對(duì)同一靶物上不同表位的抗體，或針對(duì)不同靶物的抗體的混合物。

US7262028記載了一種通過表達(dá)一種輕鏈和不同重鏈從單一宿主細(xì)胞克隆生成二價(jià)抗體或者二價(jià)抗體混合物的方法，并提供了一種用于生成抗體組合的方法，可以對(duì)該抗體組合篩選在多種應(yīng)用中的有用性。

WO/2010/084197則描述了一種從單一宿主細(xì)胞克隆生產(chǎn)包含兩種或者更多種不同抗體混合物的方法。其中一個(gè)實(shí)施方案中，為不同單價(jià)抗體的混合物。另外一種實(shí)施方案中，則為單價(jià)和二價(jià)抗體的混合物，該方法通過IgG4天然的Fab兩臂之間交換的現(xiàn)象，最終改變引起該現(xiàn)象的鉸鏈區(qū)和CH3的部分氨基酸，穩(wěn)定了同二聚體，但是該專利沒有提及是否完全解決了異二聚體存在的問題。

US5789208和US6335163曾描述過一種表達(dá)多克隆抗體文庫的方法，用噬菌體展示載體表達(dá)抗體Fab片段的多克隆文庫，然后選擇對(duì)抗原的反應(yīng)性。所選擇的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因組合被以鏈接配對(duì)的方式大量轉(zhuǎn)移至提供恒定區(qū)基因的真核表達(dá)載體，以獲得完整多克隆抗體的子文庫。這一子文庫轉(zhuǎn)染入骨髓瘤細(xì)胞后，穩(wěn)定克隆便可以產(chǎn)生能被混合以獲得單克隆抗體混合物的多克隆抗體。盡管使用這一方法通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混合群在理論上有可能直接從一個(gè)重組生產(chǎn)過程中獲得多克隆抗體，但在混合細(xì)胞群的穩(wěn)定性以及因此帶來的所產(chǎn)生的多克隆抗體的一致性方面可能存在潛在的問題。在藥學(xué)上可接受的大規(guī)模（工業(yè)）的方法中對(duì)整群不同細(xì)胞進(jìn)行控制是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。例如，細(xì)胞生長速率和抗體產(chǎn)生速率等特性對(duì)非克隆群中所有單個(gè)克隆來說應(yīng)保持穩(wěn)定，才能使多克隆抗體混合物中的抗體比率多少保持恒定。因此，盡管在本領(lǐng)域可能已經(jīng)認(rèn)識(shí)到混合抗體的需求，但還不存在可接受的解決方案以用藥學(xué)可接受的方式經(jīng)濟(jì)地制造抗體混合物。

日前，默克與丹麥的Symphogen?A/S公司簽署了Sym004的獨(dú)家全球授權(quán)協(xié)議。Sym004是一種靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）的新型在研抗體混合物。

Sym004由兩種抗體組成，可阻斷配體結(jié)合、受體活化和下游信號(hào)傳導(dǎo)，亦被認(rèn)為可通過誘導(dǎo)EGFR內(nèi)陷和降解而誘導(dǎo)EGFR從癌細(xì)胞表面清除。在目前對(duì)該藥開展的Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)中，研究者針對(duì)既往接受標(biāo)準(zhǔn)化療和市售抗EGFR單克隆抗體治療后疾病發(fā)生進(jìn)展的晚期KRAS基因野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC）患者進(jìn)行了評(píng)價(jià)。此外，目前還有一項(xiàng)針對(duì)抗EGFR治療失敗的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（SCCHN）患者的Ⅱ期試驗(yàn)。

Symphogen?A/S公司的抗體混合物技術(shù)，首先通過抗體篩選平臺(tái)的篩選獲得多個(gè)針對(duì)同一靶標(biāo)的抗體，然后進(jìn)行各個(gè)抗體的分子構(gòu)建，分別細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)，并進(jìn)行混合，最后進(jìn)行混合物逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行純化工藝優(yōu)化獲得最終的產(chǎn)品。但該方法是用多個(gè)重組宿主細(xì)胞生成多個(gè)同二聚體蛋白混合物，仍然存在細(xì)胞生長速率和抗體產(chǎn)生速率不穩(wěn)定的問題。由于該方法通過單獨(dú)的細(xì)胞表達(dá)單獨(dú)的抗體，因此不存在異二聚體的問題。

如果能在一種重組細(xì)胞中生成兩種或多種蛋白或抗體，將是更理想的生產(chǎn)蛋白或抗體混合物的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了在一種重組細(xì)胞中同時(shí)制備兩種或多種蛋白或抗體的方法，由此完成了本發(fā)明，具體包括以下幾個(gè)方面：