[發(fā)明專(zhuān)利]利用電荷排斥作用制備同二聚體蛋白混合物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310313763.7
• 申請(qǐng)日: 2013-07-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103388013A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐霆;須濤;汪皛皛;孫興魯;范英;曾燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12P21/02
• 分類(lèi)號(hào): C12P21/02;C07K16/00
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 劉向昕

1.利用一種重組宿主細(xì)胞獲得包含兩種或兩種以上的蛋白（例如抗體）的混合物的方法，所述蛋白以單體鏈與單體鏈聚合的二聚體形式存在，并且所述兩種或兩種以上的蛋白含有相同的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述方法包括將其中一種或一種以上蛋白相同結(jié)構(gòu)域中兩條單體鏈的部分氨基酸替換為帶相反電荷的氨基酸的步驟，使得不同種蛋白的單體鏈之間由于相同電荷的排斥作用而不容易形成異二聚體，而同種蛋白的單體鏈之間由于相反電荷的吸引作用而更容易形成同二聚體。

2.包含兩種或兩種以上的蛋白（例如抗體）的混合物，所述蛋白以單體鏈與單體鏈聚合的二聚體形式存在，并且所述兩種或兩種以上的蛋白之間含有相同的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其中一種或一種以上蛋白相同結(jié)構(gòu)域中兩條單體鏈的部分氨基酸被替換為帶相反電荷的氨基酸，使得不同種蛋白的單體鏈之間由于相同電荷的排斥作用而不容易形成異二聚體，而同種蛋白的單體鏈之間由于相反電荷的吸引作用而更容易形成同二聚體。

3.權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求2的混合物，其中最多有一種蛋白的氨基酸未被替換。

4.權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求2的混合物，其中所述的相同結(jié)構(gòu)域是指抗體的CH3結(jié)構(gòu)域或者抗體的Fc區(qū)域。

5.權(quán)利要求4的方法或混合物，其中所述的抗體來(lái)源于哺乳動(dòng)物，例如來(lái)源于人、小鼠或大鼠。

6.權(quán)利要求4的方法或混合物，其中所述的抗體選自IgG（例如IgG1、IgG2、IgG3）、IgA（例如IgA1、IgA2）、IgE、IgD、IgM（例如IgM1、IgM2）。

7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的將相同結(jié)構(gòu)域中的部分氨基酸替換為帶相反電荷的氨基酸，包括以下步驟：

（1）獲得所述蛋白的兩條單體鏈的相同結(jié)構(gòu)域之間的界面氨基酸；

（2）從步驟（1）獲得的界面氨基酸中挑選正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸；

（3）從步驟（2）獲得的正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸中任選一對(duì)或數(shù)對(duì)（例如兩對(duì)、三對(duì)、四對(duì)）氨基酸，將所選帶電氨基酸替換為帶相反電荷的帶電氨基酸。

8.權(quán)利要求2的混合物，其中所述的部分氨基酸為所述蛋白的兩條單體鏈的相同結(jié)構(gòu)域之間的界面氨基酸，優(yōu)選地，所述界面氨基酸為正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸；更優(yōu)選地，其中的一對(duì)或數(shù)對(duì)（例如兩對(duì)、三對(duì)、四對(duì)）配對(duì)氨基酸被替換為帶相反電荷的帶電氨基酸。

9.權(quán)利要求7的方法或權(quán)利要求8的混合物，其中所述的帶電氨基酸選自賴(lài)氨酸（lys）、精氨酸（Arg）、組氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）。

10.權(quán)利要求7的方法或權(quán)利要求8的混合物，其中當(dāng)相同結(jié)構(gòu)域是指抗體的Fc區(qū)域或CH3結(jié)構(gòu)域時(shí)，所述的正負(fù)電荷配對(duì)的帶電氨基酸選自如下a)-h)所示的配對(duì)氨基酸：

a）第一鏈的第356位Glu（E）與第二鏈的第439位Lys（K）；

b）第一鏈的第357位Glu（E）與第二鏈的第370位Lys（K）；

c）第一鏈的第370位Lys（K）與第二鏈的第357位Glu（E）；

d）第一鏈的第392位Lys（K）與第二鏈的第399位Asp（D）；

e）第一鏈的第399位Asp（D）與第二鏈的第392位Lys（K）；

f）第一鏈的第399位Asp（D）與第二鏈的第409位Lys（K）；

g）第一鏈的第409位Lys（K）與第二鏈的第399位Asp（D）；

h）第一鏈的第439位Lys（K）與第二鏈的第356位Glu（E）；

上述8對(duì)氨基酸的位置是根據(jù)抗體KABAT中EU索引的編號(hào)確定的。

11.權(quán)利要求10的方法或混合物，其中所述的相同結(jié)構(gòu)域中兩條單體鏈的部分氨基酸替換為帶相反電荷的氨基酸是指：將其中一種蛋白的392位的Lys替換為Asp，409位的Lys替換為Asp，399位的Asp替換為L(zhǎng)ys。

12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的將相同結(jié)構(gòu)域中的部分氨基酸替換為帶相反電荷的氨基酸的方法包括：獲得氨基酸替換后的蛋白的編碼核苷酸序列，用重組宿主細(xì)胞表達(dá)該編碼核苷酸序列，得到氨基酸替換后的蛋白。

13.根據(jù)權(quán)利要求1、3-7、9-12任一項(xiàng)所述的方法獲得的蛋白的混合物。