[發明專利]冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201310313597.0
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103333234A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 孫萬倉;楊剛;史鵬輝;王麗萍;劉自剛;曾秀存;方彥;武軍艷;楊寧寧;孔德晶;魯美宏;趙艷寧;董紅業;王月
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

技術領域

本發明涉及抗凍蛋白提取方法，尤其涉及冬油菜根質外體抗凍蛋白提取方法，利用該方法成功的從冷誘導的冬油菜根提取出了質外體抗凍蛋白。

背景技術

低溫是影響我國北方植物正常生長發育的主要環境因子之一。植物遇到低溫脅迫時，體內會發生一系列生理生化變化來適應低溫脅迫，同時還會合成和分泌多種蛋白質-低溫誘導蛋白。抗凍蛋白（AFPs）是低溫誘導蛋白中的一類，可在植物的根、莖、葉等不同器官中產生，也可以存在于組織培養條件下的愈傷組織，懸浮培養細胞及懸浮培養液中。它們在細胞的定位很復雜，可存在于胞間隙、細胞壁、細胞核、細胞膜、細胞質等多種細胞器中，目前發現在耐凍植物中分離的抗凍蛋白在非質體中含量較高并且具有冰晶形態效應、熱滯效應（Thermal?Hysteresis,TH）、重結晶抑制效應（Recrystallization?Inhibition）。AFPs的三個特性表明，在低溫下它與冰晶的形成直接相關，因此對植物的保護具有直接性，是植物抗寒的主要物質基礎。

1964年抗凍蛋白(AFPs)在黃粉甲幼蟲中第一次被發現后，經過半個世紀的研究，今天人們已經在魚類、昆蟲、植物、細菌和真菌等多種生物中均發現抗凍蛋白(AFPs)的存在。迄今為止，魚類、昆蟲的AFPs研究已經非常深入和系統，而植物中AFPs的發現比較晚。1992年，Griffith等第一次從經低溫鍛煉的能夠忍受細胞外結冰的冬黑麥(Secalecereale)葉片質外體中得到并部分純化了AFPs，開啟了植物抗凍蛋白的研究。之后人們在沙冬青（Ammopiptanthus?monglicus）、高山植物唐古特紅景天、胡蘿卜（Daucus?carota）、珠芽蓼(Polygonumviviparum)和冬小麥等許多植物中也發現了AFPs。

冬油菜是北方非常重要的農作物，特別是北方冬油菜要經過寒冷漫長的冬季，才能返青、抽薹、開花和結籽。根是冬油菜冬季唯一的越冬器官。因此研究根部抗凍蛋白是北方冬油菜抗寒性鑒定的有效途徑之一。油菜抗凍蛋白研究尚無成熟方法。本發明提供冬油菜根部質外體抗凍蛋白提取方法。利用該方法能夠快速有效的從油菜根部提取質外體蛋白，為研究冬油菜抗寒機理提供技術支撐。

發明內容

本發明的目的在于避免現有技術的不足，提供一種冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法。通過本發明成功的從冷誘導的冬油菜根部提取出了質外體抗凍蛋白，為進一步研究冬油菜抗寒機理提供技術支撐。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法，其主要特點是包括有以下步驟：

（1）采樣：在10至12月或至第二年1月份，在田間挖出油菜根，在3-5分鐘內放入冰盒，帶回實驗室，保存于3-5℃冰箱；

（2）提取緩沖液1000ml按下列重量體積配制：

0.05M/L?Tris-Hcl6.057g調ph到8.0；

0.01M/L?EDTA-Na2.2H2O（乙二胺四乙酸二鈉）3.72g；

0.02M/L?VC（維生素c）3.52g；

用ddH2O定容至1000ml，配好的緩沖液在3-5℃環境中保存；

（3）切條：清除油菜根部攜帶的土壤、去除根部干死部分，流水沖洗10-12min，雜物洗凈為止，用ddH₂O沖洗2遍，用濾紙吸干表面水分后，將根清洗后剖開切成1-2cm長條；

（4）浸洗：用上述緩沖液浸洗切成條的根；

（5）抽真空：將切成條的油菜根放入帶塞的容器（錐形瓶最好）中，加入80-100ml上述緩沖液，抽真空，穩定到0.07-0.08Mpa后，繼續抽真空7-10min，時間不易過長；

（6）離心：倒掉緩沖液，用濾紙吸去根表面溶液后，將其放入注射器內，將注射器放入50ml離心管，在轉速為6100-6200rpm，3-5℃，離心15min，收集離心管底部液體，即為非質體提取物。

所述的冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法，還包括有以下步驟：

（7）巰基乙醇溶液配制配方

0.5mol/L?Tris-HCL(PH=6.8)12.5％

甘油10％

β-巰基乙醇5％

ddH2O72.5％

（8）提純：

A.把步驟（6）提取物加入5倍體積的冷丙酮，-20℃預冷，在-20℃沉淀10-20h后，在轉速為10000rpm，4℃，30min離心，傾去丙酮，沉淀在-20℃揮發丙酮，獲得凍干蛋白樣品；