[發明專利]冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201310313597.0
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103333234A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 孫萬倉;楊剛;史鵬輝;王麗萍;劉自剛;曾秀存;方彥;武軍艷;楊寧寧;孔德晶;魯美宏;趙艷寧;董紅業;王月
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/30;C07K1/14
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

1.一種冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法，其特征是包括有以下步驟：

（1）采樣：在10至12月或至第二年1月份，在田間挖出油菜根，在3-5分鐘內放入冰盒，帶回實驗室，保存于3-5℃冰箱；

（2）提取緩沖液1000ml按下列重量體積配制：

0.05M/L?Tris-Hcl??????????????????????????????????????6.057g調ph到8.0；

0.01M/L?EDTA-Na2.2H2O（乙二胺四乙酸二鈉）?????????????3.72g；

0.02M/LVC（維生素c）??????????????????????????????????3.52g；

用ddH2O定容至1000ml，配好的緩沖液在3-5℃環境中保存；

（3）切條：清除油菜根部攜帶的土壤、去除根部干死部分，流水沖洗10-12min，雜物洗凈為止，用ddH₂O沖洗2遍，用濾紙吸干表面水分后，將根清洗后剖開切成1-2cm長條；

（4）浸洗：用上述緩沖液浸洗切成條的根；

（5）抽真空：將切成條的油菜根放入帶塞的容器中，加入80-100ml上述緩沖液，抽真空，穩定到0.07-0.08Mpa后，繼續抽真空7-10min；

（6）離心：倒掉緩沖液，用濾紙吸去根表面溶液后，將其放入注射器內，將注射器放入50ml離心管，在轉速為6100-6200rpm，3-5℃，離心14-16min，收集離心管底部液體，即為非質體提取物。

2.如權利要求1所述的冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法，其特征是還包括有以下步驟：

（7）巰基乙醇溶液配制配方

0.5mol/L?Tris-HCL(PH=6.8)????????????????12.5％

甘油?????????????????????????????????????10％

β-巰基乙醇??????????????????????????????5％

ddH2O????????????????????????????????????72.5％

（8）提純：

A.把步驟（6）提取物加入5倍體積的冷丙酮，-20℃預冷，在-20℃沉淀10-20h后，在轉速為10000rpm，4℃，30min離心，傾去丙酮，沉淀在-20℃揮發丙酮，獲得凍干蛋白樣品；

B.用巰基乙醇混合液溶解步驟（8）A的凍干蛋白樣品，充分溶解，再在轉速為10000rpm，4℃，15min離心，取上清液，在-20℃保存備用。