[發明專利]一種用于染色體數目異常快速檢測的半特異性擴增引物組、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201310312815.9
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN103397089A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 陳重建;梁峻彬;劉洋洋
• 申請（專利權）人: 安諾優達基因科技(北京)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及生物技術和醫學，具體涉及一組針對基因組長散在元件（Long?Interspersed?Elements，LINE）進行半特異性擴增的引物，及以該引物組為核心的快速構建DNA測序文庫的方法,同時涉及一種染色體數目異常檢測的試劑盒與方法。

背景技術

上世紀70年代中期Frederick?Sanger發明了Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain?Termination?Method）^[1]，使得直接檢測DNA序列成為了可能。其通過一個聚合酶連鎖反應（PCR）來完成測序過程。通過隨機加入ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP四種雙脫氧核糖核苷酸使得PCR擴增出不同長度的片段，通過對片段末端雙脫氧核糖核苷酸種類的檢測從而檢測出原DNA樣品的序列。該方法經過不斷的改進與完善，逐漸成為了當時主流的測序方法，即第一代測序技術。然而傳統的第一代測序方法存在著通量小、周期長、成本高等諸多缺陷，已經不能滿足研究以及應用的需要。隨著科學水平的發展，DNA測序技術也有了質的變革。以Roche/454FLX、Illumina/HisSeq以及Applied?BiosystemSOLID?system三大平臺為代表的第二代測序技術得到了充分的發展。第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序，并且通過不同的手段檢測末端的標記來確定DNA序列。DNA測序的費用越來越低，測序通量越來越高，測序速度越來越快。以Illumina/HisSeq為例，Genome?Analyzer的通量由最開始的50?M序列到后期改進后提高到300M序列，而目前最為成熟的HisSeq?2000?每次運行的通量可達300G，而人的基因組的堿基含量約為3G。換句話說，即便每個人測100G的數據，HisSeq?2000運行一次也可以檢測3個人的全基因組序列。

隨著成本的降低，通量的提高以及測序技術指標的提升，測序技術已從單純應用于研究開始越來越多地應用于實際，尤其是應用于臨床醫學領域。單基因病的檢測，染色體數目異常檢測等，個體化用藥指導等等均是在高通量測序的基礎上加以實現的。如對于慢性骨髓白血病非常有療效的甲磺酸（Gleevec）就是通過檢測測序并根據其所含信息被人們所發現的^[2]。這些大多是針對出生后個體而言，對于胎兒相關疾病的篩查也有了長足進步。這一方面取決于孕婦外周血中胎兒游離DNA的存在^[3]，另一方面取決于高通量測序技術的發展。以檢測孕婦外周血中游離DNA序列為核心，開發出了多種無創篩查胎兒疾病的方法，如鑒定RH血型、染色體拷貝數異常、大片段的染色體結構異常等^[4-5]。

目前臨床上應用測序技術檢測疾病的過程主要分為三部分：樣品獲得及文庫制備、測序、數據分析三個部分。具體而言，樣品主要為病人外周血或其他組織材料；文庫制備則主要包含DNA提取，修補平末端，3’端加A，與3’端帶有T的接頭連接，以及PCR擴增形成文庫；測序則是指將建好的測序文庫在第二代測序儀上進行測序的過程；最后得到的測序序列通過比對以及其他各種生物學模型分析，得出結論。

長散在元件（Long?Interspersed?Elements，LINE）是在真核細胞基因組中大量存在的一組元件。人類基因組中約有17%為LINEs。該元件的核苷酸序列具有非常高的相似性，并且在基因組各個染色體上均有大量的拷貝存在。因此一對特定的引物可以將大部分LINE擴增出來^[6-7]。為了進一步降低成本，提高通量以及檢測精確度，我們根據LINE元件多拷貝性以及廣泛分布在各個染色體上的特點發明了一種利用測序技術檢測大范圍的染色體數目異常的方法。該方法不僅適用于出生后個體的大范圍染色體結構變異以及染色體數目異常檢測，同時也可以實現胎兒無創的染色體數目異常檢測。具體而言，我們通過遍歷整個人類基因組的參考序列，尋找到LINEs序列，針對LINEs區域設計探針，通過兩步PCR完成DNA富集以及文庫構建的過程，并且通過后續的生物信息學分析，檢測整個染色體水平的數目異常。由于是檢測部分基因組信息，因此在相同通量下，對目的區域可以有更深的測序深度，無論是對個體DNA而言還是對孕婦外周血中游離的胎兒DNA而言都可以更精確、簡便地檢測染色體異常。

參考文獻