[發(fā)明專(zhuān)利]基于LAMP的桃內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310312627.6
• 申請(qǐng)日: 2013-07-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104178558A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許文濤;黃昆侖;閆興華;翟百?gòu)?qiáng);羅云波;徐瑗聰;商穎;董凱
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京福德安科技有限公司;中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 無(wú)
• 代理人: 無(wú)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑及方法，具體是指基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)鑒定桃內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定性和定量方法的建立。

背景技術(shù)

LAMP技術(shù)是2000年Notomi?T等發(fā)明的一種新的體外恒溫核酸擴(kuò)增方法。LAMP方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4-6條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst?DNA?polymerase，large?fragment）在恒溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，由于針對(duì)靶基因6個(gè)獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)引物，可以在1h之內(nèi)，將靶DNA片段擴(kuò)增109至1010倍。如果設(shè)計(jì)環(huán)引物，將其用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中，擴(kuò)增速率大大加快，時(shí)間可縮短至15-30min。

本發(fā)明以桃作為對(duì)象，對(duì)已經(jīng)確定的桃內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因葉綠素a/b結(jié)合蛋白（Lhcb2）基因（EF127291.1）設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，建立桃內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因等溫?cái)U(kuò)增方法，為水果源成分的分子生物學(xué)檢測(cè)提供一種快速簡(jiǎn)便的方法。由于果汁及其飲料屬于深加工產(chǎn)品，樣品中的DNA經(jīng)過(guò)一系列的加工步驟以及物理化學(xué)處理過(guò)程，易發(fā)生大量斷裂、降解甚至破壞，提取的DNA模板片段會(huì)比較小，LAMP方法的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?00bp左右，由于LAMP方法使用4條引物識(shí)別靶序列的6個(gè)區(qū)域，具有較高的特異性，因而LAMP方法非常適于果汁等加工品的檢測(cè)。該發(fā)明可為今后水果源成分的鑒定提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

為了建立了一種檢測(cè)桃內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的新型、快速的方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法，本發(fā)明提供了一套定性和定量檢測(cè)均具有較高的靈敏度的引物。根據(jù)上述引物建立了完整的檢測(cè)方法，同時(shí)提供了相應(yīng)的試劑盒。該方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，使用普通的定量PCR儀、水浴鍋及恒溫培養(yǎng)箱等即可在1h內(nèi)完成檢測(cè)?？蔀楣瓝郊贆z測(cè)提供技術(shù)支持。

本發(fā)明提供的用于桃內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測(cè)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物。根據(jù)桃葉綠體a/b結(jié)合蛋白（Lhcb2）（EF127291.1）基因使用日本榮巖株式會(huì)社環(huán)介導(dǎo)引物在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件LAMP?primer?designing?software?primerexplorer?V4.0?(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html?)設(shè)計(jì)并篩選出了1套引物，包括兩條外引物（peach863-F3/peach863-B3）、兩條內(nèi)引物（peach-FIP/peach-BIP），該引物組對(duì)于檢測(cè)桃內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因具有特異性。

上述引物的核苷酸序列分別為：

peach-F3：ATTGCACCAATTTGCCAG

peach-B3：TGACTATGCTCTCCTGTTC

peach-FIP：CACATCAGCAACATTCTATTGGTTC-

ACCTCTCTCTCACTAGAACA

peach-BIP：ATCCACAACATCTTCACATTCCC-

GGCCTAATGAGATGCCTTG

根據(jù)上述引物設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法，采用以下技術(shù)方案：

1、樣品的制備和模板的提取：將樣品在液氮中磨成粉末，稱(chēng)20mg±1mg樣品，用CTAB方法提取基因組。

2、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增：配置反應(yīng)體系，總體積25μL，包括：1.4-2.0mM?dNTP、2-8mM?MgSO4、0.6-1.0M?甜菜堿，1.6μM外引物（peach?-F3,?peach?-B3）、0.2μM?內(nèi)引物（peach?-FIP,?peach?-BIP）、3.2-8.0U?Bst?DNA聚合酶、1x?Thermopol?buffer(包含:?20mM?Tris-HCl?(pH?8.8?@?25℃),?10?mM?KCl,?10mM?(NH4)2SO4,?2?mM?MgSO4,?0.1%?.Triton?X-100)。進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

3、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：

3.1電泳法：將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如電泳圖呈現(xiàn)LAMP典型的階梯狀條帶，則樣品中有目的基因，若電泳圖無(wú)任何條帶則為陰性。

3.2染色法：加入SYBR?Green?I，觀(guān)察顏色變化：在反應(yīng)管中加入1μL?SYBR?Green?I（1000X），混勻后觀(guān)察顏色變化，若顏色變?yōu)榫G色，則樣品中有目的基因，若顏色仍保持SYBR?Green?I的橙色，則為陰性。

???本發(fā)明的第三個(gè)目的提供了快速診斷試劑盒，包括所述的引物組、上述檢測(cè)方法的反應(yīng)液、Bst?DNA?聚合酶以及一張陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。