[發明專利]基于LAMP的桃內標準基因快速檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310312627.6
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN104178558A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 許文濤;黃昆侖;閆興華;翟百強;羅云波;徐瑗聰;商穎;董凱
• 申請（專利權）人: 北京福德安科技有限公司;中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種桃內標準基因的環介導等溫擴增檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成：?

上游外引物，peach-F3：ATTGCACCAATTTGCCAG?

下游外引物，peach-B3：TGACTATGCTCTCCTGTTC?

上游內引物，peach-FIP：CACATCAGCAACATTCTATTGGTTC-?

???????????????????????ACCTCTCTCTCACTAGAACA?

下游內引物，peach-BIP：ATCCACAACATCTTCACATTCCC-?

???????????????????????GGCCTAATGAGATGCCTTG。?

2.一種桃內標的檢測方法，其特征在于，以桃葉綠體a/b結合蛋白（Lhcb2）（EF127291.1）基因為靶基因，通過環介導等溫擴增方法用權利要求1所述的檢測引物對樣品的DNA選擇性擴增所述的靶基因片段，確認是否存在有擴增產物。?

3.根據權利要求2所述的桃內標的檢測方法，其特征在于，該檢測方法具體為：?

（1）模板的提取：將樣品在液氮中磨成粉末，稱20mg±1mg樣品，用CTAB方法提取基因組。?

（2）環介導等溫擴增體系包括：1.4-2.0mM?dNTP、2-8mM?MgSO4、0.6-1.0M甜菜堿，0.2-1.6μM外引物（peach-F3,peach-B3）、0.2μM內引物（peach-FIP,peach-BIP）、3.2-8.0U?Bst?DNA聚合酶、1x?Thermopol?buffer(包含:20mM?Tris-HCl(pH8.8@25℃),10mM?KCl,10mM(NH4)2SO4,2mM?MgSO4,0.1%.Triton?X-100)，用ddH₂O補充體系至25μL。定量體系中將1μL?ddH₂O換成1μL的20X?SYBR?Green?I。?

（3）環介導等溫反應產物的檢測：?

利用電泳檢測、熒光檢測環介導反應產物是否有擴增產物。?

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品為桃葉。?

5.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，（2）中定量檢測樣品的最低限度為10pg，并且有標準曲線方程。?

6.根據權利要求3所述的桃內標環介導等溫擴增技術快速診斷試劑盒，其特征在于，普通定性環介導等溫擴增反應程序：60-65℃反應40min。反應所使用的儀器為普通PCR、水浴鍋以及恒溫培養箱。?

7.根據權利要求3所述的桃內標環介導等溫擴增技術快速診斷試劑盒，其特征在于，定量環介導等溫擴增反應程序：64℃反應3min,50個循環：64℃30s，64℃30s。反應所使用的儀器為定量PCR。?

8.桃內標環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如權利要求1所述的引物組、權利要求3所述的反應液、Bst?DNA聚合酶、顯色劑以及一張陽性定量標準曲線。?

9.根據權利要求6所述的桃內標環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒，其特征在于，所述的引物組由體積比為1:1:8:8的上下游外引物和上下游內引物組成。?

10.根據權利要求6所述的桃內標環介導等溫擴增技術快速檢測試劑盒，其特征在于，反應液是由體積比為5:8:1:8的1x?Thermopol?buffer、1.4-2.2mM?dNTP、3-9mM?MgSO₄、0.4-1.0M甜菜堿組成。?

11.根據權利要求6所述的桃內標環介導等溫擴增技術快速診斷試劑盒，其特征在于，Bst?DNA聚合酶每微升含3-8個活性單位。?

12.根據權利要求6所述的桃內標環介導等溫擴增技術快速診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒還包括SYBR?GREEN?Ⅰ熒光染料，稀釋后可作為顯色劑，另外還有一份定量標準曲線圖。?