[發明專利]一種用于產前診斷的DNA文庫構建方法

無效

• 申請號: 201310311764.8
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103361743A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 陳重建;梁峻彬;玄兆伶;王占東
• 申請（專利權）人: 安諾優達基因科技(北京)有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/08;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種用于產前診斷的DNA文庫的構建方法。

背景技術

新生兒中有少部分存在先天性遺傳病或出生缺陷，給社會和家庭帶來巨大的經濟和精神負擔。2007年中國有1564萬新生兒出生，其中出生缺陷率超過1％。出生缺陷是影響我國全民健康水平和人口素質的重要問題。國家“十一五”規劃綱要將生殖健康相關技術列為科技發展優先主題；2006-2020年國家中長期規劃也將“出生缺陷防治”作為重點領域和優先主題。我國每年約出生80～120萬缺陷嬰兒；造成經濟損失約10億元人民幣。遺傳病是新生兒缺陷的最主要原因之一，而且許多先天性出生缺陷往往缺乏有效的治療方法，因此早期診斷和預防是目前降低出生缺陷的最有效措施。

遺傳缺陷的種類多，成因復雜。比如，其中由染色體拷貝數的變化導致遺傳缺陷的疾病包括：唐氏綜合征（T21）、愛德華氏綜合征（T18）、帕陶氏綜合征（T13）等。其中由DNA?甲基化或三核苷酸重復突變導致遺傳缺陷的疾病包括：X?染色體易損綜合癥(Fragile?X)。其中由基因多態性導致遺傳缺陷的疾病包括：年齡相關性黃斑變性，假性剝脫綜合征和阿爾茲海默病。

因此，胎兒有否換上遺傳缺陷疾病是孕婦選擇進行產前檢查的主要原因，是降低畸形兒出生率最為有效的辦法之一。現在世界上進行這類診斷通常是在孕期第16到18周間進行的，辦法一是通過子宮穿刺羊膜腔，從羊水中獲取胚胎細胞，二是提取胎盤組織進行活體檢查，但這兩種辦法都比較復雜，且都是采用介入式方法進行，對孕婦和胎兒有可能引起一定的損傷，甚至有時會引發宮內感染、羊膜破裂、流產、胎兒畸形或死亡等。由于其潛在的風險，此類診斷臨床上一般只針對高齡孕婦和有家族畸形遺傳史的孕婦進行，其排查和檢測的范圍小，因此，也難以對整個新生兒先天性遺傳病或出生缺陷的產前診斷做出足夠的貢獻。

目前，開發新的方便、安全的胎兒基因或染色體診斷技術是國內外相關領域的熱點領域。隨著孕婦體內含有胎兒游離DNA的發現，和DNA大規模并行測序的應用，使無創產前基因檢測成為可能。但由于血漿中游離的DNA總量非常少，這使得如果要達到能夠完成DNA大規模并行測序DNA文庫構建所需的游離DNA的總量，需要對大量的孕婦血漿進行DNA提取；另一方面，孕婦體內胎兒游離DNA僅占孕婦血漿中總游離DNA的3%-6%。在對孕婦血漿進行游離DNA提取時，可能使胎兒的游離DNA丟失，從而導致最終測序數據出現偏差而導致檢測錯誤發生。

在無創產前基因檢測中需要一種更加方便，更加準確的文庫構建方法。本方法正是基于此而開發。本DNA文庫構建方法，直接運用孕婦血漿建庫，減少了DNA提取步驟，從而減少了孕婦血漿使用量，同時較少了胎兒DNA含量出現偏差的可能，而且大幅度的減少了DNA文庫構建的成本和時間。

發明內容

基于能夠利用孕婦外周血中游離的DNA來建立胎兒的有效DNA文庫，從而完成胎兒遺傳缺陷疾病產前無創檢測。且結果準確，無假陽性和無假陰性的基礎上，本發明提供一種產前無創檢測中快速構建游離DNA文庫的方法。

本發明構建游離DNA文庫的方法步驟如下：

1、對孕婦血漿中游離DNA進行末端修復，純化；

2、對1步驟所得DNA進行3’端加“A”堿基處理；

3、對2步驟所得DNA兩端進行加接頭處理，純化；

4、對3步驟所得DNA進行PCR，純化后DNA文庫構建完成。

本發明的另一方面涉及根據上述的任一種制備方法制得的DNA?文庫。該DNA?文庫可用于產前檢測。

一種DNA?測序方法，包括將權利要求5?所述的DNA?文庫進行測序的步驟；優選地，使用高通量測序平臺進行測序；具體地，所述高通量測序平臺為illumina測序平臺。

本發明的DNA文庫構建方法的優點是省略了從孕婦血漿中提取DNA的步驟和DNA的3’端加“A”堿基處理后的純化步驟，同時更換了PCR步驟中所用的DNA聚合酶，從而得到了與傳統方法相比，質量相同或更好的DNA文庫。本DNA文庫構建方法，直接運用孕婦血漿建庫，減少了DNA提取步驟，從而減少了孕婦血漿使用量，同時降低了胎兒DNA含量出現偏差的可能，而且大幅度地減少了DNA文庫構建的成本和時間。

附圖說明

圖1.傳統文庫構建流程與本發明文庫構建流程對比圖。