[發(fā)明專利]一種檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310310937.4
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103353526A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設計）人: 魏冬青;竇文茂
• 申請（專利權）人: 河南楓華生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京東方匯眾知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11296
• 代理人: 白潔

技術領域

本發(fā)明涉及動物疫病檢測領域，具體涉及一種檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒。

背景技術

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies?virus，PRV）引起的一種急性傳染病，多種家畜和野生動物都可以感染，以豬感染最為普遍，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失，接種疫苗是預防本病最為有效的方法。目前市面上的偽狂犬疫苗都是gE基因缺失疫苗，接種疫苗的豬只，血清中不含有豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體。如果在豬血清中檢測出了gE蛋白抗體，說明豬已經(jīng)被偽狂犬病病毒的野毒感染，可將感染的豬只淘汰，從而根除偽狂犬病。

目前一般采用間接gE-ELISA的方法來檢測豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體，這些方法的特異性不是很強，敏感度不高，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性，不可避免地會造成誤判，并產(chǎn)生不必要的損失。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種特異性強、靈敏度高，能快速、簡便地檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，包括豬偽狂犬病毒gE抗原包被的酶聯(lián)板、辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體、快速包被液、快速封閉液、樣品稀釋液、TMB顯色液、終止液、20倍濃縮洗液、陰性對照、陽性對照。

所述快速包被液是pH為10.0～14.0，濃度為0.1mol/L的NaOH；所述快速封閉液是pH為10.0～14.0，濃度為0.1mol/L的KOH。

所述樣品稀釋液中含有質(zhì)量分數(shù)為1%的酪蛋白，質(zhì)量分數(shù)為0.001%的NaN₃。

所述TMB顯色液中TMB的質(zhì)量濃度為0.3g/L；所述終止液是濃度為2M的H₂SO₄溶液。

所述20倍濃縮洗液包括質(zhì)量濃度為21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、質(zhì)量濃度為2.8g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、質(zhì)量濃度為170g/L的NaCl和體積濃度為20ml/L吐溫-20。

所述陰性對照為經(jīng)樣品稀釋液稀釋的不含豬偽狂犬gE抗體的豬血清或血漿；所述陽性對照為經(jīng)樣品稀釋液稀釋的含有豬偽狂犬gE抗體的豬血清或血漿。

所述樣品稀釋液是通過在濃度為0.01M，pH為7.2的PBS中添加質(zhì)量分數(shù)為1%的酪蛋白，質(zhì)量分數(shù)為0.001%的NaN₃制備而成。

所述20倍濃縮洗液是通過在濃度為0.01mol/L，pH為7.4的PBST中添加質(zhì)量分數(shù)為10%小牛血清制備而成。

作為優(yōu)選的，所述的快速包被液的pH為13，所述的快速封閉液的pH為13。

所述的豬偽狂犬病毒gE抗原包被的酶聯(lián)板通過如下方法制備得到：

（1）以PRV?Bartha-K61株的總DNA為模板，P1和P2作為引物進行PCR反應，其中：

引物P1的序列為：5′—GCGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGC—3′

引物P2的序列為：5′—CGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC—3′；

（2）回收的PCR反應產(chǎn)物，并將其克隆入pET28a載體的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，構(gòu)建成重組載體pET28a-E3，然后將重組載體pET28a-E3轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主菌BL21中，進行重組蛋白表達；

（3）純化重組蛋白，得到豬偽狂犬病毒gE抗原；

（4）將豬偽狂犬病毒gE抗原包被固化于酶聯(lián)板上。

所述的辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體溶液由以下方法制得：

（1）用豬IgG免疫家兔后，分離得到血清，將血清純化后獲得兔抗豬IgG抗體；

（2）用辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG抗體；

（3）將20倍濃縮洗液進行20倍稀釋后制備成原液，用原液稀釋辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體，獲得辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體溶液。

所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒在檢測豬偽狂犬病中的應用。

一種用檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒測定豬偽狂犬抗體的方法，包括以下步驟：

（1）檢測樣品制備：采血后，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清即得血清；

（2）平衡：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置室溫平衡30分鐘后使用；