[發明專利]一種檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201310310937.4
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103353526A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 魏冬青;竇文茂
• 申請（專利權）人: 河南楓華生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 北京東方匯眾知識產權代理事務所(普通合伙) 11296
• 代理人: 白潔

1.一種檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，包括豬偽狂犬病毒gE抗原包被的酶聯板、辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體、快速包被液、快速封閉液、樣品稀釋液、TMB顯色液、終止液、20倍濃縮洗液、陰性對照、陽性對照。

2.根據權利要求1所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，所述快速包被液是pH為10.0～14.0，濃度為0.1mol/L的NaOH；所述快速封閉液是pH為10.0～14.0，濃度為0.1mol/L的KOH。

3.根據權利要求1所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液中含有質量分數為1%的酪蛋白，質量分數為0.001%的NaN₃。

4.根據權利要求1所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，所述TMB顯色液中TMB的質量濃度為0.3g/L；所述終止液是濃度為2M的H₂SO₄溶液。

5.根據權利要求1所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，所述20倍濃縮洗液包括質量濃度為21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、質量濃度為2.8g/L的NaH₂PO₄·2H₂O、質量濃度為170g/L的NaCl和體積濃度為20ml/L吐溫-20。

6.根據權利要求1所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為經樣品稀釋液稀釋的不含豬偽狂犬gE抗體的豬血清或血漿；所述陽性對照為經樣品稀釋液稀釋的含有豬偽狂犬gE抗體的豬血清或血漿。

7.根據權利要求1所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，所述的豬偽狂犬病毒gE抗原包被的酶聯板通過如下方法制備得到：

（1）以PRV?Bartha-K61株的總DNA為模板，P1和P2作為引物進行PCR反應，其中：

引物P1的序列為：5′—GCGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGC—3′

引物P2的序列為：5′—CGCTCGAGTTAAGCGGGGCGGGACATCAAC—3′；

（2）回收的PCR反應產物，并將其克隆入pET28a載體的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，構建成重組載體pET28a-E3，然后將重組載體pET28a-E3轉化入大腸桿菌宿主菌BL21中，進行重組蛋白表達；

（3）純化重組蛋白，得到豬偽狂犬病毒gE抗原；

（4）將豬偽狂犬病毒gE抗原包被固化于酶聯板上。

8.根據權利要求1所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒，其特征在于，所述的辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體溶液由以下方法制得：

（1）用豬IgG免疫家兔后，分離得到血清，將血清純化后獲得兔抗豬IgG抗體；

（2）用辣根過氧化物酶標記兔抗豬IgG抗體；

（3）將20倍濃縮洗液進行20倍稀釋后制備成原液，用原液稀釋辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體，獲得辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG抗體溶液。

9.根據權利要求1～8中任何一項所述的檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒在檢測豬偽狂犬病中的應用。

10.一種用檢測豬偽狂犬抗體的試劑盒測定豬偽狂犬抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）檢測樣品制備：采血后，3000轉/分鐘離心5分鐘，取上清即得血清；

（2）平衡：將試劑盒從冷藏環境中取出，置室溫平衡30分鐘后使用；

（3）配洗液：將20倍濃縮洗液用雙蒸水稀釋20倍備用；

（4）加樣：在酶標板中分別設定空白對照、陽性對照、陰性對照，空白對照不加樣品稀釋液，陽性對照加入加入100μL陽性對照血清，陽性對照加入100μL陰性對照血清；在剩余的酶標板反應孔中中加入100μL檢測樣品，振蕩混勻；

（5）溫育：將酶標板置于室溫避光反應20分鐘；

（6）洗板：棄去反應液，反應孔中注滿洗液，浸泡15秒，棄洗液。連續洗板5次，最后拍干；

（7）加酶：反應孔中加入100μL辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG溶液，其中空白對照孔不加；

（8）溫育：將酶標板置于室溫避光反應20分鐘；

（9）洗板：洗板5次；

（10）顯色：在包括空白對照孔在內的反應孔中，依次加入TMB顯色劑100μL，振蕩混勻，室溫避光反應10分鐘；

（11）終止：在包括空白對照孔在內的反應孔中，加入終止液各50μL，振蕩混勻終止反應；

（12）測定：用酶標儀對空白孔調零，單波長450nm測定各孔OD值，并根據如下公式，并判定結果：

當測定標本OD值≥臨界值的2倍，為抗豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體陽性；

當測定標本OD值介于臨界值與臨界值的2倍之間時為可疑；

當測定標本OD值＜臨界值，為抗豬偽狂犬病毒gE蛋白抗體陰性；

其中，臨界值=0.10+陰性對照OD平均值，當陰性對照OD平均值≤0.05時，按0.05計算。