[發(fā)明專利]一種應(yīng)用臍血CD34+細(xì)胞制備腫瘤特異性DC疫苗方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310310485.X
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103405759A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡建輝;高飛;劉剛
• 申請（專利權(quán)）人: 蔡建輝;李采真
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;C12N5/0784;A61P35/00
• 代理公司: 北京鑫浩聯(lián)德專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11380
• 代理人: 高翔

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種疫苗的制備方法，特別涉及一種應(yīng)用臍血CD34+細(xì)胞制備腫瘤特異性DC疫苗方法。

背景技術(shù)

腫瘤的細(xì)胞免疫治療主要依靠DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫。DC是人體專職的抗原提呈細(xì)胞，因而在腫瘤免疫治療中，承擔(dān)著攝取和加工腫瘤抗原，將抗原信息提呈給T細(xì)胞，從而啟動腫瘤特異性T細(xì)胞免疫的重要功能。

目前臨床應(yīng)用的DC細(xì)胞主要來源于外周血單狀核細(xì)胞（Peripheral?blood?mononuclear?cells,?PBMC），而且主要應(yīng)用于個體化細(xì)胞免疫治療。由于PBMC來源DC（PBMC-DC）的個體化特征，限制了臨床應(yīng)用，特別是限制了DC疫苗的大批量生產(chǎn)及DC疫苗制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明專利創(chuàng)新性提出，應(yīng)用臍帶血單狀核細(xì)胞（Umbilical?cord?blood?derived?mononuclear?cells,?UCB-MNCs），分選出CD34+細(xì)胞（UBC-CD34+），經(jīng)過2周擴增培養(yǎng)，制備成未成熟DC（Immature?DC），擴增培養(yǎng)5天負(fù)載腫瘤抗原，成熟48小時（Mature?DC），制備成腫瘤特異性DC疫苗。

應(yīng)用UBC-CD34+細(xì)胞所制備的腫瘤特異性DC疫苗，具備以下優(yōu)點：①、臍血作為臨床廢棄物可以大量獲得和凍存，能夠滿足臨床應(yīng)用；②、從UBC-CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)，可獲得未成熟DC和成熟DC（UCB-CD34-DC）；③、UBC-CD34+細(xì)胞經(jīng)14天誘導(dǎo)培養(yǎng)的前體DC，數(shù)量上能夠擴增15-17倍，足以滿足臨床需要；④、UBC-CD34+細(xì)胞來源的前體DC和成熟DC凍存復(fù)蘇后，其細(xì)胞表型、功能、數(shù)量不發(fā)生明顯改變；⑤、和PBMC-DC相比，UBC-CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)的未成熟DC，抗原攝取、加工、抗原提呈能力更強；?⑥、和PBMC-DC相比，UBC-CD34-DC表面的功能分子表達更高，激活T細(xì)胞免疫的能力更強；?⑦、和PBMC-DC相比，UBC-CD34-DC激活的CTL，腫瘤特異性殺傷功能更強；⑧、由于UBC-CD34-DC的免疫原性極低，用于同種異體ACT治療（Adoptive?cell?transfer,?ACT），不存在HLA表型限制和免疫排斥反應(yīng)，因而可用于同種異體的細(xì)胞免疫治療（Immunotherapy），突破了細(xì)胞免疫治療的個體化瓶頸，使DC疫苗大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成為可能。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，提出應(yīng)用臍帶血來源的CD34+細(xì)胞制備DC疫苗的技術(shù)，取得了成功，本發(fā)明為此提供一種DC疫苗的制備方法，所述方法，步驟如下：

步驟1、自體腫瘤相關(guān)全抗原的制備：

步驟2、臍血的獲取：

步驟3、臍帶血單狀核細(xì)胞的獲取：

步驟4、臍帶血單狀核細(xì)胞CD34+細(xì)胞的純化：

步驟5、前體DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)：

步驟6、未成熟DC的擴增和培養(yǎng)：

步驟7、DC疫苗的制備：

其中各步驟具體操作方法如下：

步驟1、自體腫瘤相關(guān)全抗原的制備：

①、手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織：取腫瘤周邊部分組織（避免腫瘤中心的壞死組織）0.3-1.0cm³（可液氮或-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫舫車悄[瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反復(fù)洗滌3-5次，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量備用。

②、胸、腹水獲得的腫瘤細(xì)胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm離心，生理鹽水洗滌離心3次，300目鋼網(wǎng)過網(wǎng)后獲得單細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量備用。

③、同組織來源細(xì)胞株：反復(fù)凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過網(wǎng)后蛋白定量備用。

取以上自體腫瘤裂解物蛋白和同源細(xì)胞株裂解物蛋白各50%，混合制備成自體腫瘤相關(guān)全抗原。

步驟2、臍血的獲取：

①??、產(chǎn)婦選擇：選擇足月或早產(chǎn)剖腹產(chǎn)健康婦女，應(yīng)符合以下條件：年齡35歲以下；無惡性腫瘤；無遺傳性疾病；無肝炎、梅毒、艾滋等傳染性疾病；無嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥；無家族性遺傳病；無孕期輸血史。

②、胎兒選擇：胎兒體重超過3000g；無先天性疾病或畸形；

③、采血禁忌癥：胎盤剝離超過12小時；胎膜早破超過24小時；羊水檢測發(fā)現(xiàn)染色體異常；生產(chǎn)時產(chǎn)婦有感染、發(fā)熱；胎兒呼吸窘迫；羊水中有胎糞。