[發明專利]一種應用臍血CD34+細胞制備腫瘤特異性DC疫苗方法

有效

• 申請號: 201310310485.X
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103405759A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 蔡建輝;高飛;劉剛
• 申請（專利權）人: 蔡建輝;李采真
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;C12N5/0784;A61P35/00
• 代理公司: 北京鑫浩聯德專利代理事務所(普通合伙) 11380
• 代理人: 高翔

1.一種應用臍血CD34+細胞制備腫瘤特異性DC疫苗方法，所述方法，步驟如下：

步驟1、自體腫瘤相關全抗原的制備：

步驟2、臍血的獲取：

步驟3、臍帶血單狀核細胞的獲取：

步驟4、臍帶血單狀核細胞CD34+細胞的純化：

步驟5、前體DC的誘導培養：

步驟6、未成熟DC的擴增和培養：

步驟7、DC疫苗的制備。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，操作步驟如下：

步驟1、自體腫瘤相關全抗原的制備：

①、手術切除的新鮮腫瘤組織：取腫瘤周邊部分組織0.3-1.0cm³，剪除周圍非腫瘤組織，慶大霉素-生理鹽水反復洗滌3-5次，剪碎，300目鋼網研磨制備單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用；

②、胸、腹水獲得的腫瘤細胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm離心，生理鹽水洗滌離心3次，300目鋼網過網后獲得單細胞懸液，反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用；

③、同組織來源細胞株：反復凍融法制備腫瘤細胞裂解物，過網后蛋白定量備用；

取以上自體腫瘤裂解物蛋白和同源細胞株裂解物蛋白各50%，混合制備成自體腫瘤相關全抗原；

步驟2、臍血的獲取：

、產婦選擇：選擇足月或早產剖腹產健康婦女，應符合以下條件：年齡35歲以下；無惡性腫瘤；無遺傳性疾病；無肝炎、梅毒、艾滋等傳染性疾病；無嚴重妊娠并發癥；無家族性遺傳病；無孕期輸血史；

②、胎兒選擇：胎兒體重超過3000g；無先天性疾病或畸形；

③、采血禁忌癥：胎盤剝離超過12小時；胎膜早破超過24小時；羊水檢測發現染色體異常；生產時產婦有感染、發熱；胎兒呼吸窘迫；羊水中有胎糞；

④、胎兒剖出后5分鐘內，距胎兒5-7cm處雙重結扎胎兒側臍帶并于兩線間切斷，75%酒精消毒斷端，胎盤側臍帶2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器臍靜脈穿刺抽取臍血100-120ml；

⑤、采血完成后，盡快18℃保存箱內輸送到GMP實驗室，并在6小時內進行細胞分離，最晚不能超過12個小時；

步驟3、UCB-MNCs的獲取：

將上述臍血按1:1體積比加入0.01M，PH=7.4的PBS稀釋，200目篩網過濾，重懸于含15ml淋巴細胞分離液50ml離心管中，2500r/min梯度密度離心20分鐘，仔細抽吸白膜層獲取UCB-MNCs；

步驟4、UCB-MNCs來源CD34+細胞的純化：

????應用美天旎抗CD34+微小免疫磁珠，按說明書從UCB-MNCs中提取純化的CD34+細胞；

步驟5、前體DC的誘導培養：

CD34+細胞分別行生理鹽水離心洗滌3次，接種于塑料培養瓶，在含有5%自體血清的IMDM培養基中貼壁1.5小時，移除CD14+細胞，收集懸浮細胞，按照10⁶/ml的細胞密度接種于培養瓶，在含有FLT3-L?25ng/ml，TPO?10ng/ml，SCF?20ng/ml，以及5%自體血清的IMDM培養基中，37?℃、5%?CO₂飽和濕度培養2周，每2-3天換液，80%融合時移瓶，第14天收獲前體DC，可凍存備用，可繼續誘導成熟DC；

步驟6、未成熟DC的擴增和培養：

前體DC接種于含有5%自體血清的IMDM培養基2ml?的6孔板，細胞密度調整為3×10⁵/well，37?℃、5%?CO₂飽和濕度培養箱中貼壁培養1.5小時，移除懸浮細胞，貼壁細胞為未成熟DC，未成熟DC中加入GM-CSF?50ng/ml，IL-4?20ng/ml，37?℃、5%?CO₂飽和濕度培養5天，完成未成熟DC的擴增培養；

步驟7、DC疫苗的制備：

第5天加入自體腫瘤相關全抗原50μg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L?100ng/ml，并補充10%的自體血清，培養48小時，誘導DC成熟，并制備成腫瘤特異性DC疫苗，臨床接種治療或凍存。