[發(fā)明專利]基于一維長(zhǎng)柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分離鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310310332.5
• 申請(qǐng)日: 2013-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103454371A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊芃原;陸豪杰;殷薛飛;劉曉慧;申華莉;晏國(guó)全;陳晨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/89
• 分類號(hào): G01N30/89
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)組的分離鑒定方法，具體涉及基于一維長(zhǎng)柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的快速高效蛋白質(zhì)組分離鑒定方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了蛋白質(zhì)組學(xué)是研究一個(gè)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的科學(xué)，最早在90年代初期由Marc?Wilkins首先提出，其是對(duì)蛋白質(zhì)的大規(guī)模研究，包括蛋白質(zhì)的鑒定，蛋白質(zhì)翻譯后修飾及其相互作用等。已知，蛋白質(zhì)組學(xué)的生物樣品組成復(fù)雜，在檢測(cè)之前需要進(jìn)行分離以減少樣品的復(fù)雜度，目前常用的方法有十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、?等電聚焦電泳(IEF)、強(qiáng)陰/陽(yáng)離子交換(SAX/SCX)、反相液相色譜等方法。為了提高鑒定率增加蛋白質(zhì)的覆蓋度，有研究提出了一系列二維分離方法；研究實(shí)踐中，常采用聯(lián)用的方法，有SDS-PAGE與RPLC、IEF與RPLC、SAX/SCX與RPLC等，通過(guò)不同分離方法之間的聯(lián)用可提高蛋白質(zhì)的鑒定量，但是二維的分離方法耗時(shí)長(zhǎng)，消耗樣品量大，操作繁瑣；

此外，蛋白質(zhì)的鑒定是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)，常用的檢測(cè)器是質(zhì)譜，通常質(zhì)譜離子化裝置包括基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）的電離源；其中，ESI電離源因具有和液相色譜良好的兼容性常作為液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用中的離子化裝置。

鑒于目前蛋白質(zhì)的鑒定研究需要，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種一維分離鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，提供一種新的蛋白質(zhì)組的分離鑒定方法，具體涉及一種基于一維長(zhǎng)柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分離鑒定方法。該方法結(jié)合長(zhǎng)柱的一維反相色譜分離優(yōu)勢(shì)和串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)肽段的鑒定，能對(duì)蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行快速高效的分離鑒定。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

（1）選擇合適的蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理方法；

（2）選擇合適的色譜柱長(zhǎng)度；

（3）設(shè)計(jì)合適的色譜分離時(shí)間和梯度。

具體的，本發(fā)明的基于一維長(zhǎng)柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分離鑒定方法，利用長(zhǎng)色譜柱在合適梯度在7小時(shí)內(nèi)鑒定到4000個(gè)以上蛋白質(zhì)，其包括：

(1)裂解液從細(xì)胞或組織中提取全部蛋白質(zhì)混合物；

(2)蛋白質(zhì)經(jīng)沉淀，重懸，進(jìn)行還原烷基化；

(3)采用蛋白酶將待分離鑒定的蛋白質(zhì)混合物酶解成肽段混合物；

(4)將酶解獲得的肽段混合物進(jìn)行一維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。

本發(fā)明的鑒定方法中，所述的色譜柱長(zhǎng)度為色譜分離柱長(zhǎng)度大于40cm，典型的長(zhǎng)度為50cm；所述的色譜梯度為三步長(zhǎng)梯度洗脫；

本發(fā)明的鑒定方法中，所述步驟（1）中裂解液包含100mM?TrisHCl?pH?7.6?，2%以上SDS和DTT以及蛋白酶抑制劑，溶解產(chǎn)物在80攝氏度以上高溫孵育5分鐘；本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)選所述裂解液包含100mM?TrisHCl?pH?7.6?包含4%SDS和100mM?DTT以及蛋白酶抑制劑；

本發(fā)明的鑒定方法中，步驟（2）中采用甲醇-氯仿進(jìn)行沉淀；

本發(fā)明的鑒定方法中，步驟（3）中不局限于一種酶的酶解，使用胰蛋白酶、GluC或Lys-c等特異性酶中的一種或兩種以上蛋白酶任意組合對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶解；本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)選的，采用Lys-C和Trypsin組合酶解；

本發(fā)明的鑒定方法中，步驟（4）中采用50cm反相色譜柱進(jìn)行鑒定；其中，

反相色譜分離柱填料粒徑為1.8-5?μm，填料孔隙率為10nm-50?nm，反相色譜分離柱長(zhǎng)度大于40cm,典型的長(zhǎng)度為50cm，流速為100-500?nL/min；

本發(fā)明的鑒定方法中，所述三步長(zhǎng)梯度洗脫，最優(yōu)化條件為流動(dòng)相A為pH?2-5的2%乙腈0.1%FA水溶液，流動(dòng)相B為pH?2-5的98%乙腈0.1%FA水溶液，在0-30分鐘分別采用0－10％B；在30-240分鐘分別采用10－20％B的梯度；在240-340分鐘分別采用20－35％B的梯度；之后340-345分鐘均采用35－80％B剃度、345-355分鐘均采用80％B的等度洗脫、355-360分鐘均采用80-0％B的梯度；360-400分鐘采用0%B對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡。

更具體的，本發(fā)明的基于一維長(zhǎng)柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的快速高效蛋白質(zhì)組分離鑒定方法，其特征在于，包括步驟：?

（1）細(xì)胞用PBS沖洗，洗凈培養(yǎng)基后用胰酶消化細(xì)胞；