[發(fā)明專利]基于一維長(zhǎng)柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分離鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310310332.5
• 申請(qǐng)日: 2013-07-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103454371A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊芃原;陸豪杰;殷薛飛;劉曉慧;申華莉;晏國(guó)全;陳晨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/89
• 分類號(hào): G01N30/89
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.基于一維長(zhǎng)柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組分離鑒定方法，其特征在于，包括步驟：

(1)裂解液從細(xì)胞或組織中提取全部蛋白質(zhì)混合物；

(2)蛋白質(zhì)經(jīng)沉淀，重懸，進(jìn)行還原烷基化；

(3)采用蛋白酶將待分離鑒定的蛋白質(zhì)混合物酶解成肽段混合物；

(4)將酶解獲得的肽段混合物進(jìn)行一維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒定；

所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜中，色譜柱長(zhǎng)度為色譜分離柱長(zhǎng)度大于40cm，色譜梯度為三步長(zhǎng)梯度洗脫。

2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的色譜分離柱長(zhǎng)度為50cm。

3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，裂解液包含100mM?TrisHCl?pH?7.6?，2%以上SDS和DTT以及蛋白酶抑制劑，溶解產(chǎn)物在80攝氏度以上高溫孵育5分鐘。

4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，裂解液包含100mM?TrisHCl?pH?7.6?包含4%SDS和100mM?DTT以及蛋白酶抑制劑。

5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2）中，采用甲醇-氯仿進(jìn)行沉淀。

6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，使用胰蛋白酶、GluC或Lys-c特異性酶中的一種或兩種以上蛋白酶任意組合對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行酶解。

7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（3）中，采用Lys-C和Trypsin組合酶解。

8.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）中，采用50cm反相色譜柱進(jìn)行鑒定；其中，

反相色譜分離柱填料粒徑為1.8-5?μm，填料孔隙率為10nm-50?nm，反相色譜分離柱長(zhǎng)度大于40cm,典型的長(zhǎng)度為50cm，流速為100-500?nL/min。

9.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述三步長(zhǎng)梯度洗脫的條件為流動(dòng)相A為pH?2-5的2%乙腈0.1%FA水溶液，流動(dòng)相B為pH?2-5的98%乙腈0.1%FA水溶液，在0-30分鐘分別采用0－10％B；在30-240分鐘分別采用10－20％B的梯度；在240-340分鐘分別采用20－35％B的梯度；之后340-345分鐘均采用35－80％B剃度、345-355分鐘均采用80％B的等度洗脫、355-360分鐘均采用80-0％B的梯度；360-400分鐘采用0%B對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡。