[發明專利]一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法

在審

• 申請號: 201310310257.2
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN104342432A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 朱惠霖
• 申請（專利權）人: 南京諾云生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12P7/42;C12P7/40;C12R1/645;C12R1/865
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

技術領域

本發明涉及一種赤霉素前體四環性雙萜ent-貝殼杉烯酸的制備方法、及由ent-貝殼杉烯酸制備得到甜菊醇的方法，具體是涉及一種由基因工程改造的貝殼杉烯酸氧化酶參與的雙萜ent-貝殼杉烯酸的制備方法、及由ent-貝殼杉烯酸制備得到甜菊醇的方法。

背景技術

甜菊糖甙、俗稱甜菊糖、甜菊糖苷，是菊科草本植物甜葉菊提取物，其作為一種高甜度、低熱值的非發酵性的天然甜味劑已在亞洲、北美、南美洲和歐盟各國廣泛應用于食品、飲料、調味料的生產中。甜菊糖甙的甜度為蔗糖的200～300倍，而熱量只有蔗糖的?l/300，可作為植物無熱量的代糖品。

甜菊糖甙以二萜類化合物甜菊醇(Steviol)為糖苷非糖配基，根據13位上的羥基和19位上的羧基上以O-糖苷鍵相連的糖基種類及數最不同，已有至少8種糖苷被發現，其中以萊寶迪甙（Rebaudioside?A）為主。早期甜菊糖甙的生產方法主要是直接從甜葉菊植物中提取得到甜菊糖甙,?而由該方法得到的甜菊糖甙產物經常會由于提取步驟工藝過程中的雜質引入而帶有不良味道，其作為食物添加劑的安全性受到影響，且單純由植物得到的方法嚴重限制于耕作條件影響的甜葉菊產量，因此，解決上述問題的甜菊糖甙及其前提甜菊醇的合成成為研究熱點。

而赤霉素，一類化學結構屬于二萜類酸的植物激素，已有研究表明甜菊糖甙生物合成過程與赤霉素生物合成密切相關。赤霉素主要是依靠赤霉菌(Gibberella?fujikuroi)發酵工藝制得,?該工藝成熟、完善的工藝,?已有30年到40年的使用歷史，其過程中的重要中間體貝殼杉烯酸同時也是甜菊糖甙的前體物質，如下述路線所示：

?發明內容

本發明人經過研究發現，既然真菌發酵生產赤霉素已是成熟穩定的工藝,?其菌株是赤霉素高產量的生產菌株，只需要利用基因工程修改現有用于生產赤霉素真菌的菌株,把赤霉菌擁有的ent-貝殼杉烯酸氧化酶(SEQ?ID?NO：1)功能徹底刪除后，就會使ent-貝殼杉烯酸積累。然后再將甜葉菊的貝殼杉烯酸羥化酶（SEQ?ID?NO：?2）的功能插入沒有ent-貝殼杉烯酸氧化酶的功能的赤霉素菌株內，ent-貝殼杉烯酸氧化酶會將多余積累的ent-貝殼杉烯酸轉換成甜菊醇，用于進一步制得甜菊糖甙，但如何解決異源性基因高效表達的問題，是解決問題的關鍵。

根據上述研究結果，本發明的目的是提供一種解決上述技術問題的利用基因敲除技術把赤霉素真菌的ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因敲除,?導致這種酶無法在赤霉素真菌內表達,?從而避免ent-貝殼杉烯酸轉換成赤霉素A12（GA12），進而把積累的ent-貝殼杉烯酸轉換成甜菊醇的方法。

本發明的目的通過下述技術方案來實現：

一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，該方法包括：載體構建中包含ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因的敲除或/和優化后的ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因的插入，所述的萜類化合物是ent-貝殼杉烯酸、甜菊醇、萊鮑迪甙A，萊鮑迪甙B，萊鮑迪甙C，萊鮑迪甙D，萊鮑迪甙E，萊鮑迪甙F或萊鮑迪甙M。其中，ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因的敲除是為了實現?ent-貝殼杉烯酸的積累，ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因的插入是為了形成最終的目標萜類。

進一步地，優化后的ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因，其堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO：4所示。

進一步地，所述的利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其工程菌為大腸桿菌、酵母細胞、海藻細胞、植物細胞、革蘭氏陽性菌或真菌中的任意一種。

進一步地，所述的酵母細胞為釀酒酵母(Saccharomyces)細胞或亞羅酵母(Yarrowia)細胞。

進一步地，所述的革蘭氏陽性菌為芽孢桿菌(Bacillus)細胞。

進一步地，所述的真菌為鐮刀菌(Fusarium?konzum),?甘蔗鐮孢菌(Fusarium?sacchari),?藤倉赤霉菌(Gibberella?fujikuroi),?（木薯痂圓孢菌）Sphaceloma?manihoticola,?暗球腔菌(Phaeosphaeria?sp）。

一種基于基因工程改造酶制備ent-貝殼杉烯酸的方法，包括如下步驟：

（1）ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因敲除載體的構建

以藤倉赤霉菌（Gibberella?fujikuroi）基因組DNA為模板，分別擴增左右同源臂，以pCambia1302為模板擴增潮霉素基因表達框，然后以同源重組的方法將3個片段連接至pAN7-1骨架中，測序驗證后，獲得正確的敲除載體；