[發明專利]一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法

在審

• 申請號: 201310310257.2
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN104342432A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 朱惠霖
• 申請（專利權）人: 南京諾云生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/63;C12P7/42;C12P7/40;C12R1/645;C12R1/865
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

1.一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，該方法包括：載體構建中包含ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因的敲除或/和優化后的ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因的插入，所述的萜類化合物是ent-貝殼杉烯酸、甜菊醇、萊鮑迪甙A，萊鮑迪甙B，萊鮑迪甙C，萊鮑迪甙D，萊鮑迪甙E，萊鮑迪甙F或萊鮑迪甙M。

2.根據權利要求1所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，優化后的ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因，其堿基序列如序列表中SEQ?ID?NO：4所示。

3.根據權利要求1或2所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，所述的利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其工程菌為大腸桿菌、酵母細胞、海藻細胞、植物細胞、革蘭氏陽性菌或真菌中的任意一種。

4.根據權利要求3所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，所述的酵母細胞為釀酒酵母細胞或亞羅酵母。

5.根據權利要求3所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，所述的革蘭氏陽性菌為芽孢桿菌細胞。

6.根據權利要求3所述的一種利用基因工程改造酶制備萜類化合物的方法，其特征在于，所述的真菌為鐮刀菌,?甘蔗鐮孢菌,?藤倉赤霉菌,木薯痂圓孢菌,?暗球腔菌。

7.一種基于基因工程改造酶制備ent-貝殼杉烯酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）ent-貝殼杉烯酸氧化酶基因敲除載體的構建

以藤倉赤霉菌（Gibberella?fujikuroi）基因組DNA為模板，分別擴增左右同源臂，以pCambia1302為模板擴增潮霉素基因表達框，然后以同源重組的方法將3個片段連接至pAN7-1骨架中，測序驗證后，獲得正確的敲除載體；

（2）基因工程菌的獲得?

將藤倉赤霉菌（Gibberella?fujikuroi）接種到PDA固體培養上，27℃培養8天后，從新鮮斜面上取大小約0.5cm²的菌苔，磨碎后接入100ml?MYG液體培養基中，24℃，130r/min培養24小時后按1%的接種量(v/v)轉種到上述新鮮液體培養基中繼續培養15小時.菌絲用無菌水、1M的MgSO₄各洗滌一遍；取大約1g濕菌絲于10ml溶壁酶液中，37℃溫育4小時，所述溶壁酶液配置方法為：10ml的1M?MgSO₄中加入200mg溶壁酶，過濾除菌；懸浮液用3000rpm離心10min，棄去含菌絲體碎片的沉淀，上清用無菌水緩緩稀釋至MgSO₄濃度為0.5M，3000rpm離心15min，沉淀原生質體用0.5M?MgSO₄、1M山梨醇溶液各洗滌一遍，最后原生質體懸浮于1M山梨醇溶液中，適當稀釋后涂布于MYG固體再生培養基上，26℃培養2-3天，觀察再生情況；

將原生質體的濃度調為6x10⁷個/ml，取0.4ml原生質體，加入10ug或20ug線性化的質粒DNA，混合后冰浴20min，加入100ul?PEG8000溶液，混勻后冰浴20min.再加入2mlPEG?8000溶液，混勻后室溫5min以上；用4ml山梨醇溶液稀釋，3000rpm離心10min,沉淀用2ml山梨醇溶液懸浮；取0.2ml?原生質體涂布于15ml的再生培養基上，26℃培養12小時后，覆蓋10ml含潮霉素的軟瓊脂MYG，26℃繼續培養6－7天后觀察結果；

（3）轉化子的檢出

在對照沒有生長的前提下，統計轉化平板上的抗性菌落數；計算轉化率；將轉化子接種到含抗生素的平板上測定其抗性水平；分別用PCR擴增測序法及Soutern?Blot的方法進行驗證轉化子；將陽性菌落轉接到含抗生素的PDA培養基上，重復繼代篩選6次，保存菌株；

（4）發酵產物的測定

所得赤霉工程菌在PDA培養基上培養7天后，接入種子培養基50ml中，在30℃、300rpm搖床培養48小時，然后以10％的接種量轉入發酵培養基，250ml三角瓶裝30ml發酵培養基，在30℃、300rpm發酵8天；發酵液經單層濾紙過濾后將濾液pH調至2.0，濾液經0.45um濾膜過濾，所得樣品進行HPLC色譜分析。

8.一種由上述ent-貝殼杉烯酸制得甜菊醇的方法，包括如下步驟：

（1）ent-貝殼杉烯酸羥化酶基因插入載體的構建

將來自甜葉菊(Stevia?Rebaudiana?Bertoni)編碼的ent-貝殼杉烯酸羥化酶（KAH，kaurenoic?acid-13hydroxylase）的多核苷酸?(Genbank?Accession?Number:?EU722415，SEQ?ID?NO：3)進行密碼子優化后通過全基因合成的方式獲得，以用于在藤倉赤霉菌(Gibberella?fujikuroi)中表達；將優化后的編碼ent-貝殼杉烯酸羥化酶的多核苷酸(SEQ?ID?NO：4)克隆到改進后的這pAN7-1表達載體中gpdA啟動子的控制下，得到可以表達ent-貝殼杉烯酸羥化酶的質粒；所用克隆方法為同源重組的方式，所用到的擴增引物為：

F4:??5'??CTTTTCTCTTTCTTTTCCCAATGGAGGCTTCTTACCTCTACATCT??3'

R4:??5'??TCAGTAACGTTAAGTGGATCCTTATTAGAGCTCAGAGAGGAGGTTG??3'

以Gibberella?fujikuroi基因組DNA為模板，分別擴增左右同源臂；以pCambia1302為模板擴增潮霉素基因表達框，然后以同源重組的方法將4個片段連接至pAN7-1骨架中，測序驗證后，獲得正確的插入載體；

（2）基因工程菌的獲得?

將藤倉赤霉菌（Gibberella?fujikuroi）接種到PDA固體培養上，27℃培養8天后，從新鮮斜面上取大小約0.5cm²的菌苔，磨碎后接入100ml?MYG液體培養基中，24℃，130rpm培養24小時后按1%的接種量(v/v)轉種到上述新鮮液體培養基中繼續培養15小時；菌絲用無菌水、1M的MgSO₄各洗滌一遍；取大約1g濕菌絲于10ml溶壁酶液中，37℃溫育4小時，所述溶壁酶液配置方法為：10ml的1M?MgSO₄中加入200mg溶壁酶，過濾除菌；懸浮液用3000rpm離心10min，棄去含菌絲體碎片的沉淀，上清用無菌水緩緩稀釋至MgSO₄濃度為0.5?M，3000rpm離心15min，沉淀（原生質體）用0.5M?MgSO₄、1M山梨醇溶液各洗滌一遍，最后原生質體懸浮于1M山梨醇溶液中，適當稀釋后涂布于MYG固體再生培養基上，26℃培養2-3天，觀察再生情況；

將原生質體的濃度調為6x10⁷個/ml，取0.4ml原生質體，加入10ug或20ug線性化的質粒DNA，混合后冰浴20min.加入100ul?PEG8000溶液，混勻后冰浴20min.再加入2ml?PEG?8000溶液，混勻后室溫5min以上；用4ml山梨醇溶液稀釋，3000rpm離心10min,沉淀用2ml山梨醇溶液懸浮；取0.2ml?原生質體涂布于15ml的再生培養基上，26℃培養12小時后，覆蓋10ml含潮霉素的軟瓊脂MYG；26℃繼續培養6－7天后觀察結果；

（3）轉化子的檢出

在對照沒有生長的前提下，統計轉化平板上的抗性菌落數；計算轉化率；將轉化子接種到含抗生素的平板上測定其抗性水平；分別用PCR擴增測序法及Soutern?Blot的方法進行驗證轉化子；將陽性菌落轉接到含抗生素的PDA培養基上，重復繼代篩選6次，保存菌株；

（4）發酵產物的測定

所得赤霉工程菌在PDA培養基上培養7天后，接入種子培養基50ml中，在30℃、300rpm搖床培養48小時，然后以10％的接種量轉入發酵培養基，250ml三角瓶裝30ml發酵培養基，在30℃、300rpm發酵8天；發酵液經單層濾紙過濾后將濾液pH調至2.0，濾液經0.45um濾膜過濾，所得樣品進行HPLC色譜分析。