[發(fā)明專利]一種測定桿狀病毒滴度的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310309787.5
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103364560A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李晶梅;朱薇;溫文生;漆世華;謝紅玲;靖志強;李建;秦紅剛;廖園園
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒滴度（含量）測定，具體涉及一種測定桿狀病毒滴度的方法。

背景技術(shù)

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)（Baculovirus?expression?vector?system，BEVS）是一種能夠高效表達外源基因的真核表達載體系統(tǒng)。以苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcMNPV）為基本研究模型的BEVS是功用最多的、應(yīng)用最廣泛的真核細(xì)胞表達載體系統(tǒng)之一。以AcMNPV為基本研究模型的BEVS已經(jīng)充分商品化，包括多種商品化的載體、高效的轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)基，并且有成熟的構(gòu)建方法和成功案例。優(yōu)化最適病毒感染量（MOI）是提高BEVS外源基因表達量的重要手段，所以需要精確定量桿狀病毒滴度。常用的桿狀病毒滴度測定方法包括噬斑法、終點稀釋法、比色指示劑法、熒光定量PCR方法等，還有用于測定桿狀病毒滴度的商品化試劑盒，比如BACPAC商品化檢測試劑盒、Fastplas商品化檢測試劑盒。

1）噬斑法是測定病毒滴度最經(jīng)典的方法，接毒后在細(xì)胞上鋪瓊脂凝膠，培養(yǎng)5～8天，計數(shù)噬斑，通過噬斑數(shù)和稀釋度的換算，獲得病毒效價。噬斑法方法操作繁瑣，并且要求操作者有一定的操作經(jīng)驗。

2）終點稀釋法是以50%組織培養(yǎng)感染劑量（TCID₅₀）表示，接毒后細(xì)胞培養(yǎng)5～8天，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變（CPE），判定各孔是否感染。需要桿狀病毒感染細(xì)胞使細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，憑經(jīng)驗進行判斷，在細(xì)胞病變并不十分明顯的情況下有漏檢的可能，即主觀和經(jīng)驗因素對檢測結(jié)果的影響較大。

3）比色指示劑法是通過檢測細(xì)胞活性、間接判斷各孔是否感染。比色指示劑法實質(zhì)也是一種終點稀釋法，在結(jié)果判定步驟中引入比色指示劑操作，通過顏色變化判斷各孔細(xì)胞是否感染病毒。噻唑藍（MTT）是常用試劑之一，使用MTT作為比色指示劑的桿狀病毒滴度測定的方法俗稱MTT法。

4）熒光定量PCR方法通過定量病毒核酸而定量桿狀病毒，不能區(qū)分病毒死活。

5）BACPAC商品化檢測試劑盒是基于gp64蛋白和gp64單克隆抗體的檢測試劑盒，顯色系統(tǒng)為過氧化物酶和過氧化物酶底物。在噬斑法的基礎(chǔ)上進行改進，縮短了檢測時間；經(jīng)由免疫染色檢測感染細(xì)胞、辨識度高；顯微鏡下計數(shù)病灶，獲得病毒效價。

6）Fastplas商品化檢測試劑盒是基于gp64蛋白和gp64抗體的檢測試劑盒，顯色系統(tǒng)為β-gal和X-gal底物。

終點稀釋法測定病毒滴度俗稱TCID₅₀測定，是使用最為廣泛的一種病毒含量測定方法。如前所述，將傳統(tǒng)的終點稀釋法用于桿狀病毒的測定有一定的不足。所謂的不足主要是指低濃度桿狀病毒感染細(xì)胞引起的細(xì)胞病變不明顯，結(jié)果判斷易受操作者的主觀因素影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種測定桿狀病毒滴度的方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種測定桿狀病毒滴度的方法，包括如下步驟：

（1）昆蟲細(xì)胞板的制備：將對數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的細(xì)胞密度鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使昆蟲細(xì)胞貼于孔底。

（2）接種桿狀病毒：將被檢的桿狀病毒接種到昆蟲細(xì)胞板中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（3）間接免疫熒光確定被感染的細(xì)胞孔數(shù)：棄去細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)基，固定，洗細(xì)胞板，加入gp64單抗孵育，洗細(xì)胞板，再加入羊抗鼠熒光抗體孵育，洗細(xì)胞板，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜顯示亮綠色熒光判定該細(xì)胞所在孔為陽性孔。

（4）病毒滴度計算：計算病毒的TCID₅₀。

步驟（1）中所述的昆蟲細(xì)胞優(yōu)選為Sf9細(xì)胞、Sf21細(xì)胞或High?Five細(xì)胞。

步驟（1）昆蟲細(xì)胞板的制備優(yōu)選為：將處于對數(shù)生長期的、懸浮培養(yǎng)中的昆蟲細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋，稀釋后的細(xì)胞液以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的細(xì)胞密度鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時，昆蟲細(xì)胞貼于孔底，備用。

步驟（2）接種桿狀病毒優(yōu)選為：將被檢的桿狀病毒進行10倍系列稀釋，取適當(dāng)稀釋度的桿狀病毒液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.1mL/孔，每個稀釋度6～8個重復(fù)，置27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6天。