[發(fā)明專利]一種測(cè)定桿狀病毒滴度的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310309787.5
• 申請(qǐng)日: 2013-07-23
• 公開（公告）號(hào): CN103364560A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李晶梅;朱薇;溫文生;漆世華;謝紅玲;靖志強(qiáng);李建;秦紅剛;廖園園
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）昆蟲細(xì)胞板的制備：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的昆蟲細(xì)胞以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的細(xì)胞密度鋪到細(xì)胞培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使昆蟲細(xì)胞貼于孔底；

（2）接種桿狀病毒：將被檢的桿狀病毒接種到昆蟲細(xì)胞板中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（3）間接免疫熒光確定被感染的細(xì)胞孔數(shù)：棄去細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)基，固定，洗細(xì)胞板，加入gp64單抗孵育，洗細(xì)胞板，再加入羊抗鼠熒光抗體孵育，洗細(xì)胞板，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜顯示亮綠色熒光判定該細(xì)胞所在孔為陽(yáng)性孔；

（4）病毒滴度計(jì)算：計(jì)算病毒的TCID₅₀。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：步驟（1）中所述的昆蟲細(xì)胞為Sf9細(xì)胞、Sf21細(xì)胞或High?Five細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：步驟（1）昆蟲細(xì)胞板的制備為：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的、懸浮培養(yǎng)中的昆蟲細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋，稀釋后的細(xì)胞液以2×10⁴～4×10⁴/0.1mL/孔的細(xì)胞密度鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)，昆蟲細(xì)胞貼于孔底，備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：步驟（2）接種桿狀病毒為：將被檢的桿狀病毒進(jìn)行10倍系列稀釋，取適當(dāng)稀釋度的桿狀病毒液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.1mL/孔，每個(gè)稀釋度6～8個(gè)重復(fù)，置27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6天。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：步驟（3）中所述的gp64單抗是針對(duì)苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒膜蛋白gp64的。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法適用于基于苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒的桿狀病毒。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：步驟（3）間接免疫熒光確定被感染的細(xì)胞孔數(shù)為：棄去細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)基，80%丙酮固定10～20min，PBS洗細(xì)胞板，加入gp64單抗孵育，PBS洗細(xì)胞板，加入羊抗鼠熒光抗體孵育，PBS洗細(xì)胞板，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜顯示亮綠色熒光判定該細(xì)胞所在孔為陽(yáng)性孔。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：所述的80%丙酮為-20℃的80%丙酮。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定桿狀病毒滴度的方法，其特征在于：步驟（4）中所述的TCID₅₀的計(jì)算用Reed-Muench法。