[發明專利]一種牛乳源金黃色葡萄球菌Efb蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310309369.6
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103360479A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 蘇艷;劉云濤;韋海娜;姜慧嬌;張寶江
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: C07K14/31
• 分類號: C07K14/31;C12N15/70;A61K39/085;A61P31/04
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技術領域

本發明屬于生物工程和免疫技術領域，具體內容是乳腺炎牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的Efb蛋白及其編碼氨基酸序列，涉及牛乳源金黃色葡萄球菌來源的Efb蛋白的制備方法和其在免疫中的可能應用。

技術背景

近年來我國奶牛業因患奶牛乳房炎而導致我國畜牧業遭受嚴重的經濟損失。據報道，國外奶牛乳房炎的發病率約為25％～60％，在我國奶牛乳房炎的陽性率為46.4％～86.7％，奶牛臨床型和隱性乳房炎的發病率均高于國外。這也是我國奶牛產奶量低，牛奶質量差的主要原因之一。而金黃色葡萄球菌是牛乳房炎的主要病原，近50％的乳房炎是由該菌引起的。由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎已嚴重影響了我國奶牛業和乳品工業的發展，并危害到人類的健康。

奶牛乳房炎是全球性多發的疾病，一旦感染奶牛便不好根治，能夠引起奶牛產乳量下降及乳制品質量下降，導致畜牧業經濟嚴重受損。自從20世紀40年代抗生素問世以來，抗生素一直是控制奶牛乳房炎的基本藥物。對無乳鏈球菌，大腸桿菌引起的乳房炎有很好的療效。盡管目前抗生素治療仍然是控制奶牛乳房炎的主要手段，但人們也意識到單靠抗生素并不能從根本上解決奶牛乳房炎問題。

疫苗被認為是預防和治療奶牛乳房炎最有效的策略。目前研究表明，Efb是由金黃色葡萄球菌分泌到菌體外的一種大小為15.6KDa細胞外纖維蛋白原結合蛋白，為金黃色葡萄球菌表達的唯一抑制血小板聚集的蛋白。Efb是最先發現其與纖維蛋白原結合而得名，該基因在目前幾乎所有金葡菌分離株中均存在。它能夠逃避宿主的多種防御機制，已被證明是一個潛在的毒力因子。據報道，Efb能夠與補體C3b結合從而抑制補體激活，與Fg以及血小板受體GPIIb/IIa結合而阻止血小板凝集，并在小鼠傷口感染金黃色葡萄球菌模型中延遲傷口愈合。小鼠乳房炎模型證明接種Efb疫苗可明顯減少細菌寄居在乳腺組織的數量。

由于Efb對于宿主天然免疫系統的相互作用，使得Efb蛋白在金黃色葡萄球菌的定植以及感染中發揮著關鍵作用，Efb是金黃色葡萄球菌一個重要的免疫逃避因子。因此對該蛋白及其基因的研究有助于加深對奶牛乳腺炎發病過程中金黃色葡萄球菌致病性的了解，可為抗該菌的感染提供更為深入的理論基礎和新的免疫及治療靶標。

以往的研究已對金黃色葡萄球菌不同菌株的Efb的核苷酸和氨基酸序列進行了比較與分析(韋海娜，王世民，邵俊高等，牛乳源金黃色葡萄球菌Efb基因的克隆與序列分析，新疆農業大學學報2012，35(6)，469-473)，序列比較分析的結果表明分離的同一地區分離的牛源金黃色葡萄球菌Efb的氨基酸序列同源性為91-100％，不同地區分離的牛源金黃色葡萄球菌不同菌株Efb的氨基酸序列同源性為86-100％，該結果表明金黃色葡萄球菌不同菌株的Efb蛋白的序列可呈現出一定的差異。

盡管目前國內在該蛋白的研究方面有以金葡菌NCTC-8325菌株基因組為模板得到擴增片段大小為393bp，可獲得大小為20kd的蛋白該體外重組表達Efb蛋白，該蛋白被驗證對補體的激活具有抑制作用(張鑫，高亞萍，董潔等，金黃色葡萄球菌Efb蛋白的表達、純化及功能抗體的制備，軍事醫學科學院院刊，2009，6(33)：531-534)，但該蛋白在免疫方面的研究和利用在國內少見報道。基于我們以往的研究結果已經表明牛源金黃色葡萄球菌不同菌株的Efb蛋白的序列呈現出一定的差異。該序列的差異必將影響該蛋白的免疫原性。因此為有效防制由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎，我們對來自于牛乳源金黃色葡萄球菌Efb蛋白進行克隆與表達，進而對其免疫原性進行研究與應用。本發明中我們的出發菌株為牛乳源金黃色葡萄球菌，所擴增得到的基因片段的大小為426bp，與以往研究中以金葡菌NCTC-8325菌株基因組為模板克隆所得到的Efb基因的來源和基因的大小均不同，所表達的蛋白大小也是不同的。

發明目的

針對目前新疆地區奶牛養殖業對牛乳腺炎疫苗的研究的需要，本發明分離的新疆地區乳腺炎牛乳中的金黃色葡萄球菌，從該致病菌株基因組中克隆了Efb基因并測定其序列推導出其相應的氨基酸序列。并將隆到原核表達載體pET-28a中獲得重組克隆，轉化至工程菌BL-21中并對改蛋白進行誘導表達及純化，利用該蛋白序列有可能制備防治該病感染的亞單位疫苗。

發明內容

(1)Efb基因PCR擴增引物的設計與合成

根據GenBank中已發表的金黃色葡萄球菌Efb基因序列自行設計一對特異性引物，經該引物的擴增應得到426bp的條帶。