[發(fā)明專利]一種從食醋發(fā)酵過程中提取微生物總基因組的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310309256.6
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103409410A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王敏;聶志強;鄭宇;申雁冰;韓玥;駱健美;牛丹丹
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程樣品中微生物總基因組的通用提取方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

中國傳統(tǒng)食醋的釀造過程是微生物自然發(fā)酵的過程，其風(fēng)味和口感與微生物產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物(如有機酸、醇、酯等)密切相關(guān)。傳統(tǒng)食醋的生產(chǎn)過程與微生物菌群的演替密切相關(guān)，主要包括淀粉糖化、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵三個階段，其發(fā)酵狀態(tài)可分為固態(tài)發(fā)酵、半固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。在傳統(tǒng)食醋生產(chǎn)過程中，穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)不僅決定了食醋生產(chǎn)的正常進行，而且保證了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，通過分析食醋釀造過程中微生物群落的組成和豐度演替規(guī)律，對食醋生產(chǎn)監(jiān)控具有重要的意義。目前關(guān)于傳統(tǒng)食醋釀造工藝中微生物菌群的研究已經(jīng)大量開展，但是這些研究也面臨著關(guān)鍵的難題，由于環(huán)境中有99%的微生物無法在實驗室中實現(xiàn)純培養(yǎng)，僅采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離的研究方法很難檢測出主要功能微生物的種類及豐度變化，食醋釀造過程中仍有大量可能具有重要功能的未培養(yǎng)微生物沒有被發(fā)現(xiàn)。隨著分子生態(tài)學(xué)技術(shù)(如變性梯度凝膠電泳DGGE/溫度梯度凝膠電泳TGGE)、高通量測序和宏基因組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，使得研究未培養(yǎng)的微生物成為可能。這些基于基因序列分析的研究關(guān)鍵在于高質(zhì)量的微生物總基因組的提取，以避免由于提取方法不當(dāng)所造成的數(shù)據(jù)丟失，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前已經(jīng)報道的關(guān)于食醋的醋醅樣品中微生物基因組提取方法多采用“液氮研磨+溶菌酶+SDS高鹽抽提”法，該方法僅針對醋酸發(fā)酵階段固態(tài)的醋醅樣品中微生物基因組的提取進行優(yōu)化，而由于醋醅的狀態(tài)不同于其他發(fā)酵階段的樣品，如酒精發(fā)酵階段液態(tài)的酒醪樣品，因此這種提取方法并不適合食醋其他發(fā)酵階段樣品中微生物總DNA的提取。已經(jīng)公布的類似的基因組提取專利，如中國專利《固態(tài)發(fā)酵微生物總DNA提取方法》(專利號：ZL2007100356764.4)，中國專利《一種從醬香白酒大曲中提取微生物真菌總DNA的方法》(專利申請?zhí)枺?00910228704.3)，中國專利《通過預(yù)處理獲得高質(zhì)量酒醅微生物基因組DNA的方法》(專利申請?zhí)枺?01210344426.X)，均是以固態(tài)的樣品為研究對象，或以提取真菌的總DNA為目的，或針對酒醅樣品做一系列預(yù)處理后再提取總DNA。然而，在食醋整體釀造過程中，各階段的樣品既有液態(tài)的又有固態(tài)的，且樣品中有多種復(fù)雜微生物共存，這些方法不僅不能保證提取的質(zhì)量和效果，而且存在一定的局限性。因此，開發(fā)一種高效通用的微生物總基因組提取方法對于進一步分析傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程中微生物菌群的組成及演替規(guī)律具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合從傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程中不同狀態(tài)的食醋樣品中提取微生物總基因組DNA的通用方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

①食醋發(fā)酵樣品預(yù)處理：取液態(tài)或半固態(tài)樣品0.2-5g在4℃6000-8000×g離心10-30min，棄上清，于-80℃預(yù)凍后，真空冷凍干燥，研磨樣品至粉末狀，待用；固態(tài)樣品置于-20℃預(yù)冷的無菌研缽中，傾入液氮，研磨樣品至粉末狀，待用。

②微生物基因組DNA的抽提：向預(yù)處理后的樣品中加入1.0mL-2.0mL?DNA提取液，置于37℃的恒溫振蕩搖床在200-400rpm振搖15-30min后，加入質(zhì)量比1%-5%的SDS(十二烷基硫酸鈉)，充分混勻后置于65℃水浴鍋中孵育1-3h，每15min-20min顛倒幾下。向抽提液中加入1-2倍體積的PEG(聚乙二醇)8000(20%-40%，溶于1.6mol/L?NaCl，體積比)室溫放置1-2h，10000-12000×g離心10-30min，棄上清，將沉淀溶于1-2mL?TE緩沖液(10mmol/L?Tris-HCl，1mmol/L?EDTA,pH8.0),加入乙酸鉀(3-5mol/L)溶液,4℃放置15-60min，12000-15000×g離心10-20min，取上清，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液(酚∶氯仿∶異戊醇體積比25∶24∶1)，12000-15000×g離心10-30min。

③除雜及漂洗濃縮：吸取步驟②DNA抽提后的上清水相，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液(氯仿∶異戊醇體積比24∶1)，混合，12000-15000×g離心5-10min，吸取上清，加入醋酸銨-異丙醇混合液，-20～-80℃放置1-3h沉淀DNA，12000-15000×g離心10-20min，棄上清，取沉淀。用預(yù)冷的70%乙醇漂洗沉淀，12000-15000×g離心5-10min，棄上清，室溫放置，直至乙醇揮發(fā)完全，加入50-100μL雙蒸水溶解沉淀，得到微生物基因組總DNA。